材料和试剂

1. 清除组织培养处理的6个-Well微孔板（Costar公司康宁® ，Millipore公司-Σ，C atalog号：CLS3513 ）

2. 微量离心管（1.5 米升）（FISHERBRAND ，目录号：2043-05408129）

3. Countess TM 细胞计数室载玻片（Thermo Fisher，Invitrogen，Thermo Fisher ，目录号：C10228）

4. 细胞系：LLC-PK 1 肾小管上皮细胞系（欧洲认证细胞培养物保藏中心，目录号：86121112）

5. 细胞培养基和试剂：

Dulbecco 改良的Eagle培养基（D-MEM），低葡萄糖，含L-谷氨酰胺和110 mg / L 丙酮酸钠（Gibco，Thermo Fisher，目录号：11885084）

胎牛血清（Gibco，Thermo Fisher，目录号：12483-020）

青霉素-链霉素，100 x ，无菌过滤，细胞培养测试（Sigma - Aldrich，目录号：P- 4333。25300062）

胰蛋白酶-EDTA（0.05％胰蛋白酶与EDTA 4Na）（Thermo Fisher，Gibco，目录号25300062）

用于转染的Opti-MEM TM I还原血清培养基（Thermo Fisher，Gibco，目录号：31985088）

6. 用于Countess TM 自动细胞计数器（Invitrogen，Thermo Fisher，目录号T10282）的台盼蓝染色剂（0.4％）（Gibco，目录号：15250061）。

7. Lipofectamine TM RNAiMAX 转染试剂（Invitrogen，Thermo Fisher，目录号13778150）

8. 两个针对猪claudin-2的定制设计的siRNA（Thermo Fisher / Dharmacon ）（序列1，CCAGAACTCTCGCGCCAAA和序列2 CCCTGATAGCTGGGATCAT）

9. Silencer TM 阴性对照1号siRNA（非相关（NR））siRNA（Applied Biosystems / Ambion ，Thermo Fisher，目录号：AM4611）

10. ECIS电极阵列，类型：8W10E或8W10E + PET（应用生物物理学，目录号：8W10E或8W10E +）

11. L-半胱氨酸（Millipore-Sigma-Aldrich产品目录号：C7 352）

12. 用于电极稳定的10 mM L-半胱氨酸溶液（请参阅食谱）

设备

ECIS ® Z-西塔仪器与容纳在培养箱16孔阵列模块（应用生物物理学）
Countess TM 自动细胞计数器（Thermo Fisher，Invitrogen，Thermo Fisher ，目录号C10228）
组织培养设备（无菌罩，培养箱，离心机）

软件

ECIS ž θ 软件
图形软件（例如Excel或GraphPad）

程序

半胱氨酸预处理可稳定电极
用200μl 过滤的10 mM L-半胱氨酸在室温下预处理电极15分钟。
吸出半胱氨酸溶液，并用200μl 高压灭菌的dH 2 O 洗涤两次。不要用PBS清洗电极。
播种细胞之前，先风干电极。或者，可以将已处理和干燥的电极在室温下保存直至失效。

分裂上皮细胞以转染siRNA
在37 ° C，5％CO 2 的培养箱中，在补充有10％FBS和1％Pen-Strep的低葡萄糖DMEM中培养LLC-PK 1 细胞。
当细胞长到约90％汇合时，将其拆分。
使用标准细胞培养程序将种子细胞转染到6孔板中。
每孔使用2 ml不含抗生素，含血清的DM EM接种种子细胞。旨在第二天获得30-40％的汇合度。

转染细胞
第二天（16-24小时后）使用Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂以100 nM阴性对照（非相关性，NR）或claudin-2特异性siRNA转染细胞，如下所示：

混合试剂：
试管A：对于每种要转染的条件（孔），准备siRNA：在无菌微量离心管中，在无血清的200μlOpti-MEM培养基中稀释2.4μl100 nM储备siRNA双链体。轻轻混合。对于更多的井，请根据需要扩大数量。

管B：对于每个条件（井）制备的Lipofectamine TM ：加入3 微升的Lipofectamine TM RNAIMAX 至200μl的Opti-MEM培养基。轻轻混合。对于更多的井，请根据需要扩大数量。

将试管在室温下孵育5分钟。
混合管A和B的内容物以生成siRNA-Lipofectamine复合物。孵育15分钟。
在孵育时间结束时，将400μlsiRNA-Lipofectamine混合物添加到相应的孔中。轻轻摇晃以混合，然后返回培养箱。
生长细胞24小时。

在电极阵列上播种细胞
第二天，准备播种的电极阵列：
将dd 400μl预热的完全培养基（带有血清和抗生素的生长培养基）预热至孔中，并在接种细胞之前放入培养箱中15分钟。这将用血清覆盖表面并加热阵列，以减少由于热差引起的培养基/细胞悬液的对流，这会影响电极上细胞的均匀沉降。

用对照siRNA和claudin-2特异性siRNA转染的胰蛋白酶消化细胞。当细胞漂浮时，加入温热的培养基，收集细胞，然后以300 xg的速度离心下来。重悬于新鲜培养基中。进行细胞计数时要注意保暖。
使用Countess自动细胞计数器对细胞进行计数：
使用无菌尖端除去10μl细胞悬液，并在微量离心管中与10μl锥虫蓝混合。将其添加到Countess TM 细胞计数室中，并使用自动细胞计数器对细胞进行计数以获得活细胞数。

注意：可以使用手动计数代替伯爵夫人。

使用温暖的培养基调节体积，以使最终体积为400μl的电极总数达到0.5 x 10 5 个。
从培养箱中移出阵列，并从孔中吸出培养基。向每个孔中添加400μl细胞悬液。
将电极插入培养箱中的ECIS阵列支架，并拧紧支架。

软件设置和获取数据
打开电脑和ECIS上ž θ 机。
打开ECIS软件。点击“设置”按钮。系统将检查连接。如果连接良好，则孔显示为绿色。如果连接不良（红色孔），请重新插入电极，然后单击“检查”以使用“检查”按钮确认所有电极的连通性。
选择电极的类型。选择“多个频率/时间（MFT）”选项（可以在分析过程中选择所需的频率）。
点击“开始”。输入文件名和要保存的任何注释。收集数据24-48小时。
随着细胞的生长，C在高频率（32或64千赫）降低（参见Ñ OTE 6对频率的选择的评论）。当C最小稳定时，达到融合。此时，可以停止测量。

数据分析

准备数据进行分析
我n个ECIS软件在右上角点击“分析”选项卡。图2显示了具有典型测量值的软件屏幕截图，并标有相应的命令。您可以选择要导出的参数和曲线。这限制了导出的数据量。或者，您可以导出所有数据（见下文）并在图形软件中进行处理。但是，在导出之前选择分析所需的数据可以简化数据集的管理。

选择显示参数：在“孔配置”中，选择要使用的孔（图2）。在顶部，选择以显示要使用的参数，在图表下方选择以显示频率。对于细胞生长，请使用高频（32或64 kHz）的电容（C）。对于跨上皮电阻，请在低频下选择Z（我们使用500 Hz）。
标准化数据：这对于比较不同日期的测量值或起始值的可变性使比较困难时很有用。在“时间序列”选项中，单击“标准化”。使用0 h点进行归一化。这将确保可以比较不同日期收集的数据。图3A和3 乙š 测量之前和归一化后如何。
结合并行测量：Ÿ OU必须结合所有平行测量，并将其导出为一个单一的数据集，以限制出口数据集的大小的选项。为此，在“井配置”中选择代表平行测量的井。单击Grp（组）。这将计算测量值的平均值并将其显示为一条曲线。计算每种条件的平均值（图3C）。
对导出数据进行任何其他调整：调整图形以反映您要导出的数据：在“井配置”（左下方）中，选择要导出的孔（单个测量值或不同条件的分组值）。在图形下，调整X轴以显示所需的时间范围（图2）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903017--1492 KatalinSzászi861628 \ Figs jpg \ figure 2.jpg

图2. ECIS软件的屏幕截图，显示了协议中描述的典型测量结果。使细胞在置于Holder A中的8W10E +阵列中生长。条件如下：1-4（左侧）：NR siRNA转染；5-8（右侧）Cldn-2 siRNA转染。显示的电容设置为32 kHz。协议中描述的软件中的各种选项均标有绿色箭头，蓝色文本框表示各种选项。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903017--1492 KatalinSzászi861628 \ Figs jpg \ figure 3.jpg

图3. 使用ECIS软件导出的数据，经过或未经过各种处理。AC。如协议中所述，导出了具有各种分析步骤的图形。A.所有数据示（从图图表URE 1）。B.将数据标准化到测量的第一点。C.根据条件将数据分组。黑色：NR siRNA；粉色：Claudin-2 siRNA。D. 确定恢复时间的一半。数据已导出到Excel，并使用带有线选项的散点图进行了绘制。蓝色：NR siRNA；红色：Claudin-2 siRNA。绿色水平线表示0.5 C值（Y轴），蓝色和红色虚线表示相应的时间（X轴值）。

导出图形图像和数据
可以使用“文件”，“导出图形”命令将图形导出为图像。打开要导出的图像后，选择顶部的保存图标，然后设置您要使用的文件名和格式。但是，此图像在使用小字体时质量较低。另一个选择是从图形中导出数据并使用图形软件进行处理。对于此打开的“文件”，选择“导出数据”，然后选择“图形数据”。这种导出模式只会将图表上显示的数据保存为* .csv格式。您也可以在“导出数据”命令中使用相应选项导出所有数据。这将导致导出在所有频率收集的所有数据。

使用绘图软件进行处理
尽管可以导出图形图像，并且生成的图片具有所有标签，但是这些标签无法更改，并且图形和标签的质量较低。因此，我们通常将数据导出到用于进一步处理的绘图程序和用于产生出版质量的曲线图（图URE 3D）。

分析TER
比较两种情况下的势垒的一种模式是在结形成后的给定时间点比较Z。在图URE 1B我们从两个测量（与图中所示的绘制Z值URE 1A底部图，并从不同的一天的类似系列实验的）。

分析细胞生长
为了比较在不同实验中获得的数据，我们为每次测量计算电池覆盖电极一半所需的时间（该时间对应于0.5 C值）。对于这种分析，我们使用该数据从所述电容（C）值在32千赫，归一化到第一测量点（一个或多个EE 步骤2）（图URE 3D）。收集所有条件的时间值，并计算每个条件的平均值±SD。

统计
必须至少在3个不同的实验中执行测量。对于每个数组的每个条件，我们至少使用重复项。数组之间的直接比较可能会带来挑战，因为原始值在不同的实验中显示出可变性。例如，从图1B所示的不同日期获得的两个阵列组合而来的TER数据显示，来自同一实验的数据更靠近在一起，但是其值不同于在另一个阵列上测得的值。尽管在这两种情况下，claudin-2 siRNA转染的细胞均显示出升高的TER，但组合数据集上未配对的t 检验显示变化并不显着。如C值所述，将数据标准化并表示为倍数变化可以解决此问题。如果选择该方法，则应使用非参数统计检验。

笔记

阵列类型：可用的电极阵列类型多种多样，但电极数量不同。阵列具有的电极越多，要测量和平均的单元就越多，从而可以降低噪声，但灵敏度也较小。根据实验类型选择合适的电极很重要。有关每种ECIS 文化软件的详细说明，请访问Applied BioPhysics 网站：https : //www.biophysics.com/cultureware.php 。
为了检测细胞生长和连接发育，我们使用了8W10E 或8W10E +。10E +具有更多的电极来收集信息。重要的是，对于给定的一系列实验，请始终使用相同的数组。

电极包被：根据所用细胞类型的特性，可以在植入细胞之前使用胶原蛋白，纤连蛋白，层粘连蛋白或其他细胞外基质蛋白包被电极。细胞外基质蛋白有助于细胞粘附并调节多种细胞功能，例如细胞增殖，分化，迁移和存活。用于包被的蛋白质类型也可能影响增殖和屏障的形成，尽管必须针对特定细胞进行系统研究。因此，重要的是在整个实验过程中标准化涂层条件。我们发现LLC-PK 1 细胞不需要特殊的涂层，因为它们在金电极上生长良好。
细胞数量和接种：接种技术是孔之间可比性和重现性的关键。孔之间的高度可变性可以掩盖增殖的差异。这通常是由于接种不一致和细胞数量变化所致。为了进行准确的测量，所有孔中的细胞数必须保持恒定。准备均匀的细胞悬液用于播种是关键。彻底胰蛋白酶消化细胞并混合悬浮液以消除细胞簇。当使用来自不同条件（例如转染）的细胞时，准确计数细胞悬液以获得可比数量也很重要。最后，对阵列和细胞悬液进行预热以消除孔底部和悬液之间的温差也至关重要。对于随后的细胞生长，必须使用低细胞数以使细胞在粘附后增殖。如果细胞数太高，则细胞在粘附后会融合，并且不会发生增殖。通常在头3小时内细胞粘附和扩散就完成了，在此时间范围后，细胞会通过增殖建立融合层。
应常规检测细胞株的支原体污染。
转染参数：转染条件取决于所使用的细胞二系和靶蛋白，因此可能需要优化条件。靶蛋白的敲低效率应通过蛋白质印迹或qPCR并行确认。转染细胞中汇合的变化应使用电容测量进行评估。阵列上的细胞可以使用显微镜观察。另外，对各个紧密连接蛋白的作用也是有益的，可以通过免疫荧光评估。
电容和阻抗测量的频率选择：设置系统时，建议使用在所有可用频率下收集数据的设置。由于对通过电池以及电池之间的电流的抵抗力不同，因此在不同交流频率下测得的参数将反映电池特性的不同方面。在分析期间，用户可以为感兴趣的参数选择频率。高频下确定的电容反映了电极的覆盖范围，而受其他参数（例如势垒功能）的影响最小。该软件中用于分析电容值的当前建议和默认值为64 kHz。值得注意的是，该软件的较早版本具有最高和默认的C值32 kHz，因此我们在较早的研究中使用了此设置。在此频率下，C还反映出电极覆盖率。相比之下，旁细胞间隙的电阻（称为紧密功能产生的屏障功能）最好由低AC频率反映出来。进出口edance（ż ）在500Hz的值和下面反映细胞旁空间的显性抗性。该软件还能够执行数学建模，从而可以进行进一步的分析，并更好地区分细胞旁空间和细胞下方空间的抵抗力（细胞-基质附着）。有关详细信息，请参阅Stolwijk 等。（2015）。

菜谱

10 mM L- 半胱氨酸溶液，用于稳定电极
向50 ml dH 2 O中添加0.06 g L-半胱氨酸
过滤消毒
半胱氨酸溶于水后很容易氧化，因此必须重新配制该溶液

致谢

资金来源：加拿大肾脏基金会；加拿大卫生研究院（CIHR）授予PJT-149058和MOP-142409。

该协议源自：Amoozadeh 等。，2015；Dan 等。，2019 。

利益争夺

作者声明他们没有财务或非财务利益冲突。

参考文献

Y. Amoozadeh，Anwer，S.，Dan，Q.，Venugopal，S.，Shi，Y.，Branchard ，E.，Liedtke，E.，Ailenberg ，M.，Rotstein，OD，Kapus，A. and Sz á SZI ，K。（2018）。细胞汇合调节claudin-2的表达：ZO-1和Rac的可能作用。Am J Physiol Cell Physiol 314（3）：C366-C378。
Y.Amoozadeh，Dan，Q.，Anwer，S.，Huang，HH，Barbieri，V.，Waheed，F.，Maishan ，M.和Szaszi，K.（2017）。肿瘤坏死因子-α增加肾小管细胞中claudin-1、4和7的表达：在通透性变化中的作用。细胞生物学杂志232（8）：2210-2220。
Amoozadeh，Y.，Dan，Q.，Xiao，J.，Waheed，F.和Szaszi，K.（2015）。肿瘤坏死因子-α 诱导肾小管上皮细胞中claudin-2表达的双相变化：在屏障功能中的作用。Am J Physiol Cell Physiol 309（1）：C38-50。
Dan，Q.，Shi，Y.，Rabani ，R.，Venugopal，S.，Xiao，J.，Anwer，S.，Ding，M.，Speight，P.，Pan，W.，Alexander，RT，Kapus ，A。和SZ á SZI ，K。（2019）。Claudin-2抑制GEF-H1，RHOA和MRTF，从而影响肾小管细胞的增殖和纤维化表型。生物化学杂志294（42）：15446-15465。
加西亚í 一个，E.，P é REZ，P.，奥尔莫，A.，d í AZ，R.，尔塔斯，G。和ÿ ú 费拉，A。（2019）。用于细胞培养监测的电阻抗测量数据分析模型。传感器（巴塞尔）19（21）：e4639。
Hagen，SJ（2017年）。claudin蛋白的非规范功能：超越细胞间粘附的调控。组织屏障5（2）：e1327839。
Kakiashvili，E.，丹，Q.，VanderMeer的，M.，章，Y.，瓦希德，F.，范，M。和SZ á SZI ，K。（2011）。表皮生长因子受体介导肿瘤坏死因子-α诱导肾小管上皮细胞ERK / GEF-H1 / RhoA途径的激活。生物化学杂志286（11）：9268-9279。
大号á 纳克，O.，ķ ö hidai ，L。和韦格纳，J。（2017）。无标记的细胞动力学分析：一系列基于阻抗的测定法，用于评估体外肿瘤细胞的侵袭性。Exp Cell Res 359（1）：243-250。
McClatchey ，AI和Yap，AS（2012）。接触抑制（增殖）恢复。Curr Opin Cell Biol 24（5）：685-694。
Stolwijk ，JA，Matrougui ，K.，伦肯，CW和Trebak ，M。（2015）。GPCR介导的内皮屏障功能变化的阻抗分析：概述和稳定和可重复测量的基本考虑。Pflugers Arch 467（10）：2193-2218。
Szaszi，K.，Vandermeer，M.和Amoozadeh，Y.（2012）。ECIS研究了上皮伤口愈合和细胞因子的作用。Jiang，W.（Ed 。）。于：细胞-细胞底物阻抗感测与癌症转移。癌症转移-生物学和治疗，第17卷。施普林格，多德雷赫特。131-175。
Tsukita ，S.，Tanaka，H.和Tamura，A.（2019）。Claudins：从紧密的连接到生物系统。趋势生物化学Sci 44（2）：141-152。
Venugopal，S.，Anwer，S.和Szaszi，K.（2019）。Claudin-2：渗透性功能之外的角色。国际分子科学杂志20（22）：5655。
Wegener，J.，Keese ，CR和Giaever，I。（2000）。电细胞-基底阻抗感测（ECIS）作为一种非侵入性手段，可以监测细胞扩散到人造表面的动力学。Exp Cell Res 259（1）：158-166。
Zihni ，C.，Mills，C.，Matter，K.和Balda ，MS（2016）。紧密连接：从简单的屏障到多功能分子门。Nat Rev Mol Cell Biol 17（9）：564-580。