材料和试剂

P ipette提示
开顶薄壁聚丙烯离心管，175 微升，5×20毫米（Beckman Coulter公司，目录号：342630）
硫酸铍（BeSO 4· 4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：14270）
乙二醇双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'- 四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
鸟苷5'-三磷酸钠水合物（GTP）（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
氯化镁溶液（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：63069）
哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：30603）
氟化钠（NaF ）（Sigma-Aldrich，目录号：S7920）
BRB80缓冲溶液5 x （请参阅配方）
GDP解决方案（请参见食谱）
微管蛋白库存（请参见食谱）
NaF 解决方案（请参阅食谱）
BeSO 4 解决方案（请参阅食谱）
G-BRB80-BEF 3 - （见配方）
BRB80-BEF 3 - 溶液（见食谱）

设备

Pipetman Classic P100，P20，P10（Gilson，目录号：F123615，F123600，F144802）
Airfuge 空气驱动（贝克曼库尔特，目录号：340401）
固定角转子的A-110（Beckman Coulter公司，CATA 日志号码：347596）
冰箱MEDIKA 100 ECT-F（抽屉）
压缩空气冷却器BEKOBLITZZ LC12（Beko Technologies，目录号：4020103）
压缩空气过滤器CLEARPOINT ，1 μ M（贝科技术，目录号码：S040SWT）
膜式干燥机Drypoint M plus（Beko Technologies，目录号：4007626）
冷凝水排放ECD型号ED12
B2000超声波清洗器（布兰森）
DRI -块加热器DB-2D（Techne公司）
Uvikon XS 分光光度计（Secomam ，Bio-Tek Instruments）
石英比色皿超微池（Hellma，目录号105-201-15-40）
具有导热HY流体的Julabo F30-C（Julabo ），-60°C至+65°C，（Julabo ，目录号：8940104）
具有热HY流体的Julabo MP-5（Julabo ），-60°C至+65°C，（Julabo ，目录号：8940104）
三通阀，PFTE （Bürkle ，目录号：8610-0006）

软件

LabPower v3.50（Secomam ，Bio-Tek仪器）
Excel（微软）
亲和力设计师（Serif Ltd）

程序

分光光度剂的制备
开启分光光度计，并确保其使用350 nm的紫外灯。
注意：在Uvikon XS 上，从UV（D2）切换到卤素灯的默认值为340 nm 。该值必须更改为例如360 nm，因为必须将UV灯与350 nm的超微池石英比色皿一起使用。

选择350 nm 的自动速率模式。
打开温水浴，将温度设置为35°C，使其平衡15分钟。
注意：必须使用装满水的石英比色杯内的小型热电偶来调节冷热循环浴的温度。目标是在聚合和解聚条件下分别达到35°C和4°C。环境温度的变化（例如，夏季和冬季之间）可能需要定期控制和调整这些设置。聚合过程中不要超过35°C，因为微管蛋白在高于该温度时很容易变性（Weis et al。，2010）。

交换机上的冷水浴，将温度设定为2℃并让平衡30分钟。
使分光光度计恒温池支架内的35°C流体循环（图1）。

D：\重新格式化\ 2020-7-1 \ 2003101--1487DenisChrétien861629 \无花果jpg \图1.jpg

图1.分光光度计的温度控制。A.将两个在35°C和2°C下调节的水浴连接到分光光度计的恒温6 + 6电池更换器。三通阀允许将温度从35°C（底部）快速切换到4°C（顶部）。所述的温度冷水浴必须低于4℃被设定，由于在管道系统中的流体的预热。必须使用小型热电偶定期检查电池座内部的实际高温和低温温度。B.温暖（左）和冷（右）沐浴池。C.三通阀。这些必须同时切换。

微管种子准备（30（升）
在手指之间快速解冻10μl 等分试样的微管蛋白（初始浓度22 mg / ml），并保持在4°C直至使用。
注意：通过在高分子量缓冲液中组装两个周期从猪脑中纯化微管蛋白（Casolddi 和Popov，2003年），然后进行循环步骤以在E位点获得与GDP配伍的微管蛋白（Ashford等人，1998年）。）。循环微管蛋白是可商购的，例如购自PurSolution （https://puresolve.com/cycled-tubulin/）。Ť 在22的终浓度ubulin毫克/毫升在100μl和10μl等份等分，急速冷冻在液氮中，并储存在-80℃直至使用。微管蛋白解冻后，请尽量减少所有步骤，直到聚合为止，因为如果以未组装的形式保存，即使在4°C时，它也会迅速变性。

添加5.5微升的微管蛋白溶液中，以24.5 微升G-BRB80-BEF的3 - 在聚丙烯离心管中。
将离心管在Airfuge中以141,000 x g （A-110转子，22 psig ）离心5分钟，4°C（图2）。
注意：呼吸机的温度不受调节。它必须在冰箱中在图2中被放置在冷室中，或可替代地，如在这两种情况下，所述进入空气流也必须被冷却，否则转子将预热（见manufactu RER 的指令，如果安装在冷室）。

将上清液在干式加热器中孵育1小时，温度为35°C。
在超声清洁器中超声微管1分钟。
将微管种子保持在35°C，直到用于下一步。

D：\重新格式化\ 2020-7-1 \ 2003101--1487DenisChrétien861629 \图jpg \图2.jpg

图2. 气浮器的温度控制。将Airfuge 保持在冰箱内4°C的温度下。进入的压缩空气在到达离心机之前也必须进行冷却，以避免离心过程中转子预热。

微管接种的组件，然后在350 nm处进行分光光度法（对于100（l）
快速解冻20μl微管蛋白的等分试样（初始浓度22 mg / ml）。
添加18个OFL 此微管蛋白溶液中，以82 微升BRB80-BEF的3 - 在聚丙烯离心管中。
将离心管在Airfuge中以141,000 xg （A-110转子，22 psig ）离心5分钟，4°C。
将上清液在干式加热器中孵育5分钟，温度为35°C。
移取90毫升预热的微管蛋白溶液，并加入10微升预热的种子。
将混合物转移到石英比色杯中，并将其放入分光光度计内。
按自动归零，以2点/分钟的速度开始录制。
聚合大约1小时后，将流体切换至2°C 恒温槽以引发微管解聚（图1）。
当OD基线跟踪保持稳定时，停止记录。
将数据保存为Excel格式（.xls ），并绘制350 nm（∆ OD 350 nm，au 。）处的光密度变化与时间（min）的关系（图3）。

D：\重新格式化\ 2020-7-1 \ 2003101--1487DenisChrétien861629 \无花果jpg \ Fig3-word.jpg

图3. GDP-BEF的组装3 - -microtubules在种子的存在和不存在。在种子存在下组装的微管冷解聚后，OD降低至零以下（纯系），因为这些微管有助于样品的初始浊度。在没有种子的情况下（虚线），OD切换至4°C后几乎保持稳定。这表明OD的少量增加主要是由于微管蛋白聚集体的形成。

数据分析

所述LabPower 使用软件来控制UVIKON 在XS分光光度计和获取数据的自动定速率模式，其进一步保存在Excel（.xls的）格式。将数据导入Excel以可视化光密度与时间图的变化。数字是在Affinity Designer中准备的。

菜谱

BRB80缓冲溶液5 x
0.4 M PIPES，用KOH调节至pH 6.8
5 mM MgCl 2
5 mM EGT A
在4°C下保存长达一个月
GDP解决方案
在BRB80中为20 mM 1 x
分成20份等分试样，
在-20° C下储存长达一年
微管蛋白储备液
22 mg · ml -1 纯化的猪脑微管蛋白
在-80°C下储存长达一年
在BRB80中的200 mM NaF 溶液1 x 在4°C下储存长达一个月

BeSO 4 溶液
在BRB80中为20 mM 1 x
在4°C的温度下保存长达一个月
G-BRB80-BEF 3 -
1 X BRB80
20mM的氟化钠
的5mM BESO 4
1mM的GDP
25 ％甘油
ķ 在4℃下EEP直至使用。
BRB80-BEF 3 - 解决方案
1 X BRB80
20mM的氟化钠
的5mM BESO 4
1mM的GDP
ķ 在4℃EEP直至使用。
不E：准备新鲜BRB80-BEF 3 - 解决方案SI NCE BEF 3 - 盐并不稳定。

致谢

这项工作由法国国家侦察局（ANR-16-C11-0017-01）资助。该协议源自Estévez-Gallego 等人，2020。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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Castoldi ，M.和Popov，AV（2003）。通过在高分子量缓冲液中进行两个聚合-解聚循环来纯化脑微管蛋白。Protein Expr Purif 32（1）：83-88。
Estévez- Gallego，J.，Josa -Prado，F.，Ku，S.，Buey ，RM，Balaguer，FA，Prota ，AE，Lucena-Agell ，D.，Kamma-Lorger ，C.，Yagi，T.， Iwamoto，H.，Duchesne，L.，Barasoain ，I.，Steinmetz，MO，Chrétien，D.，Kamimura ，S.，Díaz，JF和Oliva，MA（2020）。微管末端生长时差异帽成熟的结构模型。eLife 9：e50155。
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