材料和试剂

注意：确保所有的试剂和材料AR ËRN 一个SE- 免费。除非另有说明，否则材料应在室温下保存。

1.5 ml E ppendorf管（Eppendor f，目录号：0030120086）
1毫升厚壁聚碳酸酯超速离心管（贝克曼，目录号：343778）
封口膜
超纯无核酸酶水（Invitrogen，目录号：10977-035）
蔗糖（Sigma，目录号：84097）
琼脂糖（Pronadisa，目录号：8010.00）
乙醇（默克，绝对分析，目录号：51976）
异丙醇（Merck，绝对分析，目录号：I9516）
苯酚：clorophorm：异戊醇（25：24：1）（Sigma，目录号：P2069，存储在4 °C）
Chroma-Spin STE-10纯化柱（宝酒（Takara），目录号：636055）
氯化镁1 M溶液（Sigma，目录号：M1028）
醋酸镁（Sigma，目录号：M5661 ）
醋酸钾（Sigma，目录号：P9541）
醋酸钠（Sigma，目录号：S2889）
Trizma base（Sigma，目录号：93362）
EDTA（Sigma，目录号：03677）
LiDS（Sigma，目录号：L9781）
核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物（包括1mM氨基酸混合物）（Promega，目录号：4960，储存在-70 °C ）
GMP-PNP（Calbiochem，目录号：sc-215113，储存在-20 °C ）
RNase抑制剂（New England Biolabs，目录号：M0307S，储存在-20 °C ）
HighScribe T7聚合酶试剂盒（新英格兰生物实验室，目录号：E2040S，存储在-20 °C ）
4-thio-UTP（Jena Biosciences，目录号：NU-1156S，在-20 °C下低温）
Oligo d（T）25磁珠（New Engl 和Biolabs，目录号：S1419S，存储在4 °C ）
糖原（Illumina，货号：15073019，存储在-20 °C ）
QIAquick凝胶提取试剂盒（QIA GEN ，目录号：28704）
用于RT-PCR的SuperScript III第一链合成系统（Invitrogen，目录号：18080-051，存储在-20 °C ）
RNase H（Invitrogen，货号：18021-014，储存在-20 °C ）
Supreme 2x Green Master Mix（NZYtech，目录号：MB05403，储存在-20 °C ）
Phusion DNA聚合酶（New England Biolabs，目录号：M0530S，存储在-20 °C ）
CHROMA SPIN-30 + TE-30（宝藏，货号：636069）
DNA clean＆Concentrator-25（Epigenetics，货号：D4005）
Trizma base（S Sigma ，目录号：93362）
Agencourt AMPURE XP（贝克曼犁刀，目录号：A63880）
DNA Kb阶梯（New England Biolabs，目录号：N3232L）
环化酶（Illumina，目录号：ASLPA1212，存储在-20 °C ）
底漆（全部来自西格玛，存储在-20 °C ）：
18S_rev：CACCTCTAGCGGCGCAATACG

adapter_ligation：[phos] AGATCGGAAGCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGT

18S适配器：AGACGTGTGCTCTTCCGATCTCACCTCTAGCGGCGCAATACG

PR_f wd：ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAG

索引：CAAGCAGAAGAACGGCATACGAGA NNNNNNN GTGACTGGAGTTCAGACGT GTGCTCTTCCGATCT

Flat_fw：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGACCCACCAACACAGCACCA T GAACAACGAGCCACCGACAGG T GA T GAG T GA T GACGGAGGCACACACGACAGACAACCGAGAGAGCAGAACGAGACCACAC

U_rev polyA ：（T）25 GTGTGGTCTCGTTCTGCTC

T7_U_fw：GGATCCTAATACGACTCACTATAGGG

多核糖体缓冲液（请参见食谱）
TE缓冲区（请参见配方）
1个TAE缓冲区（请参阅食谱）
SuperScript III cDNA合成混合物（每个反应）（请参见食谱）
Circligase酶混合物（每个反应）（请参阅食谱）
裂解/结合缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液1（请参阅食谱）
洗涤缓冲液2（请参阅食谱）
低盐缓冲液（请参阅食谱）

设备

P20，P200和P1000 Pipetman自动移液器（Gilson）
TL100超速离心机（贝克曼）
TLA 100.2转子
带有2个6W 360 nm灯的灯座（Philips，型号：TL6W ）（自制）
涡流（Biosan，涡流V-1 plus）
-20 °C 冰柜（Liehberr）
通风柜
温控器（Eppendorf，舒适）
配备金属块的热块（LabNe t，Accublock）
纳米d ROP分光光度计（Thermo Scientific的，型号1000）
磁力分离器机架（新英格兰生物实验室，目录号：S1506S）
台式离心机（Thermo，型号：M egafuge 16R）
微型离心机（海蒂诗，微升）
凝胶电泳系统（Bio-Rad，型号：Mini-Sub Cell GT System）
生物分析仪（Agilent，型号：2100）
NextSeq 550系统（Illumina）

软件

FASTX工具版本0.0.13 （http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit）
Bowtie 2 v2.3.5.1 （http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）（Langmead和Sal zberg，2012年）
功能计数。可用在http://www.bioconductor.org（廖等人。，2014 ）

程序

通过体外转录制备包含4-thio-UTP（4 s U-mRNA）的mRNA
我们合成了一个128 nt的mRNA，该mRNA含有最少的二级结构，带有短（19 nt）的 5'UTR和3’聚腺苷酸。可将光活化的4-硫代-UTP并入mRNA的位置+2（AUG的A表示为+1），+ 24，+ 27，+ 31或+34。我们使用浓度比UTP高四倍的4-thio-UTP，以确保每个mRNA分子都被至少一个4-thio-UTP标记（图1 A）。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 2003073--1478伊万·文托索856370 \图jpg \图2.jpg

图1. 鉴定mRNA的协议概述：体外组装的48S复合物中的18S rRNA接触。A. 在RRL中用于组装翻译起始复合物（48S-PIC）的mRNA的示意图。用4-硫代-U标记的mRNA中的位置相对于AUG i 编号。B. 通过4-硫代-U的特异性交联，然后进行逆转录酶终止位点（RTTS）测定和下一代测序（NGS）来鉴定mRNA-18S rRNA接触的实验方法概述。

DNA模板制备
将终浓度为1 uM的引物Flat_fw和U_rev polyA与50 ml的1x Supreme绿色母液混合，并在95 °C 下孵育5分钟，然后在45 °C 下孵育1分钟，然后在72 °C 下孵育10分钟。
然后，使用2μl的该混合物在50μl1x Supreme绿色预混液（30个循环，95 °C 2分钟，45 °C 2分钟）中使用T7_U_fw和U_rev polyA引物（最终浓度均为0.5μM）编程进行PCR扩增。，72 °C 45 s，最终延伸72 °C 10分钟）。
使用2μl样品通过在TAE 1x 缓冲液中的1.5％琼脂糖凝胶中电泳检查PCR产物的大小（约200 nt）。
然后，用DNA clean＆Concentrator-25柱纯化PCR片段，通常以0.3-0.5μg/μl的量产生25μl。
mRNA的合成与纯化
程序的体外转录采用在-4-硫代UTP的存在HighScribe T7聚合酶试剂盒。
混合以下成分20的最终体积微升：
2 微升10X反应缓冲液的

每次1μlATP / CTP / GTP 20mM（终浓度1mM）

1 微升UTP 5毫米（0.25 毫终浓度）

1 微升-4-硫代UTP的20mM（终浓度为1mM）

0.5 微升的RNasin ® 加RNA酶抑制剂

1个微克DNA模板

2 微升T7ř NApol

在黑暗中于H 2 O和Incube t s置于20 ml中，在37 °C下放置2-3 h 。
在37 °C下用1 ml DN 和I（1U / ml）消化DNA模板15分钟。然后，用H 2 O 使混合物的最终体积达到40 ml 。
然后将混合物装入预先装好的chromaspin-30色谱柱中，并在室温下在台式离心机中以700 xg离心5分钟。
回收洗脱，并使用1微升来测量RNA浓度Ñ ANO d ROP分光光度计（通常0.2-0.5微克/微升）。将mRNA储存在-70 °C 。

兔网织红细胞裂解液（RRL）中翻译起始复合物（48S-PIC）的组装和UV交联
程序2个100 ml的有4个翻译混合物到U型mRNA的非水解GMP PNP的存在以促进48S的积累前起始复合物（PIC）（Figu 重新1 ）。其中一个样品不会受到照射（对照）。

48S-PIC组装
每重复混合以下组分nts：
70 微升的RRL（最终体积的70％）

16μlH 2 O

2μl氨基酸混合物（1 mM）

8μl醋酸镁20 mM（终浓度2.5 mM）

2μl的GMP-PNP 100 mM（终浓度2 mM）

2微升的核糖核酸酶在抑制物

℃预温育，在30 5分钟℃，然后加入0.5微克的4 小号U型的mRNA。
轻轻混合并在30 °C 下再孵育25分钟。
将试管放在冰上以终止反应。
UV交联。
切下一块封口膜并将其放在两个金属块之间，塑料盖朝上。
固定组装体C arefully与弹性橡胶B ANDS预冷，并在-20至少2小时℃下。
小心地取下上部模块和塑料盖，然后将底部封口膜和封口膜放在冰箱上，如下所示（图2 ）：

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 2003073--1478伊万·文托索856370 \图jpg \图1.jpg

图2 。ü V灯组件上的样品用于交联。如图所示，将样品（红点）放在石蜡膜上进行紫外线照射。最多可以同时照射六个样品。

使用P200移液器将其中一个样品放在封口膜上，并用尖端将其延伸以形成2厘米直径的涂片。
将灯座放在盒子上，使紫外线灯离样品3厘米远，照射20分钟。
让另一个样品在冰上（非辐照对照）。

从完整核糖体I沉淀物中分离聚（A）mRNA
将已辐照和未辐照的样品（100μl）转移到冰上新的E ppendorf管中，并缓慢加入800μl 多核糖体缓冲液（配方1）
充分混合并小心地将混合物（850-900μl）放在1 ml超速离心管中制成的蔗糖垫上（100μl 多核糖体缓冲液中的20 ％蔗糖溶液）。
将试管放入TLA 100.2转子中，并在4 °C下以250,000 ×g 离心3 h 。在此步骤中，核糖体沉淀类似于半透明的小扁豆。
用P1000移液器移出上清液，并用200μlTE缓冲液轻轻洗涤核糖体沉淀3-5 s，避免用尖端接触沉淀。
重复洗涤两次以上。加入500μl裂解结合缓冲液（配方6），让沉淀在室温下溶解15分钟。
从未辐照的样品中保存30μl等分试样，以分离总RNA（请参见下文）。
向其余的溶液中加入200μl 预先在500μl裂解/结合缓冲液中平衡5分钟的olid d（T）25 磁珠（0.25 ml的5 mg / ml悬浮液）。
在旋转转盘中以30 rpm的温度在室温下孵育15分钟。
将试管放入磁力架，然后将磁珠拉到试管的侧面。
然后除去并丢弃上清液，然后向珠中加入0.5 ml的洗涤缓冲液1（配方7）。
旋转混合1分钟（如S t ep C 8中所述）并如上所述捕获珠子。
再用洗涤缓冲液1重复洗涤一次，用洗涤缓冲液2（配方8）重复两次，再用低盐缓冲液（食谱9）重复一次。
最后，向微珠中加入100μlH 2 O，并在热混合器中于50 °C 加热2分钟以洗脱RNA。
测量浓度在Ñ ANO d ROP（通常50-100纳克/ 毫升），并存储在-70 ℃下。

总RNA提取
要提取总RNA，请用H 2 O 将之前保存的30μl等分试样（S tep C 6）升至200μl 。
然后，加入200μl苯酚：氯仿：异戊醇，并剧烈涡旋1分钟。
让试管静置5分钟，然后再涡旋三遍。
在室温下以微型离心机以最大速度离心5分钟，然后将上层相转移到新管中，避免接触到相间。
最后，在-20 °C O / N 下，用2体积的100％乙醇和0.2 M乙酸钠pH 5.2（最终浓度）沉淀RNA 。
在4 °C 的微型离心机中以最大速度离心15分钟，然后用0.5 ml的70％乙醇洗涤沉淀。
在室温下重复离心，除去乙醇，让沉淀在工作台上干燥5分钟。
然后，将沉淀溶解在20 ml H 2 O中，并储存在-70 °C下。

18S rRNA的逆转录
使用辐照过的，未辐照过的和总RNA样品，按照制造商的规定使用引物18S_rev（靶向18S rRNA）进行逆转录：

将0.5μgRNA 样品（通常为5-10μl）与0.5μM的18S_rev和1μl的10 mM dNTPs混合，最终体积为10μl。
通过在65 °C 下加热5分钟使RNA变性，然后将试管置于冰上1分钟。
准备SuperScript III cDNA合成混合物（配方4），并向RNA样品中添加10μl。
在50 °C 孵育50分钟，然后在85 °C 加热10分钟终止反应。短暂地旋转试管，并将其放在冰上。
然后将1μlRNase H加入试管中，并在37 °C 孵育20分钟以降解RNA。
按照制造商的建议，使用AMPURE XP磁珠纯化cDNA，但使用两倍以上的磁珠保持较小的片段，网址为https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=B37419。
洗脱样品在15微升H的2 O.

衔接子连接和首次PCR扩增
衔接子连接至所述3 ' OH cDNA和环化的是与CIRCLIGASE进行最终体积20 微升，含有10微升纯化的cDNA，2.5μM adapter_ligation 引物和10微升酶CIRCLIGASE微米的IX（配方5）。
将样品在60 °C下孵育2小时，然后在68 °C 下孵育1小时，然后在80 °C下孵育10分钟。
让样品在冰上至少2分钟。
使用PR_fwd和18S衔接子引物（0.5μM）和5 x Phusion HF缓冲液，用Phusion D NA聚合酶进行最终体积为10μl 的第一次PCR扩增。
要优化扩增，请尝试上述三种不同体积的连接cDNA混合物（0.5、1和2μl）。

使用以下参数对PCR进行编程：
在95 °C下初始变性3分钟，然后在95 °C下进行15 s，在50 °C下进行15 s，在72 °C下进行20 s 的30个循环，最后在72 °C 下进行10分钟。

在1％琼脂糖-TAE凝胶中运行每个样品的2μl等分试样，以检查扩增大小（预期条带在100-950 nt之间）。

使用引物进行第二次PCR扩增
使用3μl的第一次PCR扩增程序，以PR_fwd 和INDEX 引物（终浓度为0.5μM）编程第二次PCR扩增。对每个样本使用不同的索引示例（在这种情况下为三个）。

使用与上述相同的参数执行PCR扩增，但将循环数减少至10。
然后，将样品加到H 2 O 中至40μl，并按照制造商的说明用AMPURE XP珠子纯化PCR片段。
洗脱样品20 微升水中2 O和检查它们在生物分析仪。
预计p 分布在100-950 nt的范围内（见图3A）。在某些样品中，观察到大约150 nt的强峰，该峰可能对应于衔接子二聚体。在这种情况下，通过在150 nt 标记物上方切割一块凝胶，在1％琼脂糖-TAE凝胶中进行样品的大小分级。使用QIAquick凝胶提取试剂盒从琼脂糖块中提取DNA。

D：\重新格式化\ 2020-6-1 \ 2003073--1478伊万·文托索856370 \图jpg \图3.jpg

图3.获得的结果示例。A.琼脂糖凝胶电泳的典型图片，显示了从总RNA和捕获的寡核苷酸（T）获得的最终PCR文库（右图）。左图显示了与从上方捕获的寡核苷酸d（T）对应的电泳图。在生物分析仪中分析样品，并通过蓝括号指示获得的DNA峰范围。尺寸标记也显示（M）。B. 在组装成48S-PIC的mRNA交联后，5 ' 逆转录（RT）阻滞在18S rRNA上的典型直方图。将总或寡核苷酸（dT）纯化的RNA进行18S rRNA的逆转录酶终止位点（RTTS）分析。绿色箭头表示一些富含寡核苷酸（dT）纯化的RNA的捕获物。经常在总RNA中观察到C726处强烈的RT阻滞，可能是由于纯化过程中18S rRNA的断裂。

排序
通过调整到较低浓度的样品来混合生成的索引库（在这种情况下为三个），以得到混合物中每个库的相似表示。发送样本以在NextSeq550平台中进行测序，读取次数为1x75。典型输出为0.5Mreads /样本。

数据分析

来自测序的FASTQ文件在FASTX软件管道（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/galaxy.html）下进行处理：

使用FASTQ Barco de splitter和索引序列对测序读数进行多路分解：
ç ommand行：猫sequencing_complete.fastq | fastx_barcode_splitter –bcfile条码_sequences.txt –bol –前缀“ / sequenceing / RTTS_” --suffix“ .fastq” 。

使用FASTQC Clipper选项删除索引序列。删除缺少适配器的序列：
ç ommand行：fastx_clipper -a ADAPTER_S 层序-c -i INFILE -o OUTFILE 。

使用FASTQ Quality Filter选项执行基于质量的序列过滤，删除至少80 ％的分子中质量分数低于20的所有序列：
Ç ommand行：fastq_quality_filter -q 20 -p 80 -I INFILE -o OUTFILE）。

使用默认参数Bowtie 2 将序列与兔18S rRNA（登录号X06778.1，https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X06778 ）进行比对：
Ç ommand行：bowtie2 -q -x rabbit_18S_indexes -U sequences.fq -S aligment.output.sam。

对齐后，使用FeatureCounts软件使用read2pos5 参数（命令行：featureCounts input_files.sam –o output_file.txt –read2pos5 ）提取每个读取的5'末端位置。然后，我们使用命令cut -f 3 feature_counts_input.txt | 排序-g | uniq -c> final_output.txt 生成一个表，其中包含读取5'端18S rRNA的每个核苷酸的频率表示。精确的交联位点被认为是相对于每个读图的5'端的-1位置。
一旦绘制了每个样品在18S rRNA序列上的交联位点，就应确定那些富含寡聚（T）捕获RNA样品的阻滞剂。为此，将数据减去使用总RNA而非未交联样品获得的数据。通常，我们只考虑占总读数> 0.5％的交联位点。

菜谱

多核糖体缓冲液
Tris - HCl 20 mM pH 7.5

氯化钾100 mM

氯化镁2 2 mM

DTT 2毫米

TE缓冲液
10 mM Tris pH 8.0

1毫米EDTA

1个TAE缓冲区
40 mM三乙酸

1毫米EDTA

SuperScript III cDNA合成混合物（每个反应）
2μl10x RT缓冲液

4微升25 mM氯化镁2

2微升0.1 M DTT

1微升RNaseOUT

1μlSuperScript III RT

Circligase酶混合物（每个反应）
2μlCL 10x反应缓冲液

1微升ATP

1微升MnCl 2

1μlCircligase

5微升H 2 O

裂解/结合缓冲液
的20mM Tris-HC 升（pH7.5）中

500毫米氯化锂

0.5％LiDS

1毫米EDTA

5毫米DTT

洗涤缓冲液1
的20mM Tris-HC 升（pH7.5）中

500毫米氯化锂

0.1％LiDS

1毫米EDTA

5毫米DTT

洗涤缓冲液2
的20mM Tris-HC 升（pH7.5）中

500毫米氯化锂

1毫米EDTA

低盐缓冲液
的20mM Tris-HC 升（pH7.5）中

200毫米LiCl

1毫米EDTA

致谢

劳拉·巴巴多（Laura Barbado）的技术支持得到认可。这项工作由经济与竞争部长（BFU2017-84955-R）资助。

利益争夺

作者声明既没有利益冲突也没有竞争利益。

参考文献

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