材料和试剂

1. 12 - 孔玻璃显微镜载玻片（赛默飞世尔科技，产品目录号：MENX2XER202W）

2. 醋酸铵（Merck，目录号：A7330）

3. 二水合氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（Merck，目录号：C5080）

4. 钙离子载体A23187（默克，目录号：C7522），p owder储存在4℃; 分装储备溶液并保存在-20 °C

5. 考马斯亮蓝G-250（默克，目录号：B0770）

6. D-葡萄糖（Ajax，目录号：783）

7. DABCO（默克，目录号：D27802）

8.二丁酰基环状单磷酸腺苷（Merck，目录号：D0627）

9. Diff- Quik 差分染色试剂盒（Dade Behring，目录号：564-850-02）

10. DPX 贴剂（Merck，目录号：06522）

11. Eosin Y（默克，目录号：E4382）

12. 异硫氰酸荧光素（FITC）缀合的PSA从凝集素豌豆（豌豆）（Merck公司，目录号：L0770），š tored在4 ℃下

13. 甲醛37％v / v（默克，目录号：252549）

14. 果糖（Merck，目录号：F0127）

15. 冰醋酸（Biostrategy ，目录号：20104.332）

16. 甘氨酸（默克，目录号：G8898）

17. Ham's F-10营养混合物（MP Biomedicals，目录号：091440049）

18. HEPES缓冲区（GE Healthcare，目录号：SH30237.01）

19. 从凝集素豌豆（豌豆）（Merck公司，目录号：L5380），š tored在4℃下

20. 七水硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（默克公司，目录号：M5921）

21. 甲醇（POCD Scientific，目录号：Meth25P）

22. Mowiol 4-88（默克公司，目录号：81381），粉末在室温下保存，分装溶液并在-20°C下保存

23. 多聚甲醛水溶液（Proscitech ，目录号：15710）

24. 青霉素-链霉素（Merck，目录号：P4458 ）

25. 己酮可可碱（默克，目录号：P1784）

26. Percoll （GE Healthcare，目录号：17-0891-01），存储在4°C下

27. 磷酸盐缓冲盐水（默克，目录号：P4417）

28. 聚乙烯醇（Merck，目录号：A8136）

29. 氯化钾（KCl的）（Merck公司，目录号：P9333）

30. 一元磷酸钾（KH 2 PO 4 ）（Merck，目录号：P5655）

31. 黄体酮（默克，目录号：P0130）

32. 碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（Merck，目录号：S6297）

33. 氯化钠（Merck，目录号：S7653）

34. 柠檬酸钠（默克，目录号：S1804）

35. 丙酮酸钠（默克，目录号：P3662）

36. 乳酸钠（默克，目录号：L1375）

37. Tris（MP Biomedicals，目录号：152176）

38. 无菌过滤水，适合用于细胞培养（Merck，目录号：W3500）

39.为BWW增容（请参阅食谱）

40. 考马斯乙略染色（见配方）

41. HOS 介质（请参阅食谱）

42. 稀释精子的固定剂（请参阅食谱）

43. Mowiol 安装解决方案（请参阅食谱）

44.无容量的BWW（请参阅食谱）

45. Percoll 工作解决方案（请参阅食谱）

46. BWW储备溶液（请参阅食谱）

设备

Finnpipette F1可变容积移液管（赛默飞世尔科技，1至10微升，20至200微升，100 1 ，000微升）
荧光显微镜（蔡司，型号：Axio Imager A1）
生物相差显微镜（奥林巴斯，型号：CX41 ）
微型渗透计（Fiske，210型）

程序

高质量人类精子的分离
为了评估顶体反应，优选使用高迁移率的精子制剂，其不含诸如白细胞，生殖细胞和死精子的污染物。因此，下面我们描述了一种与射精中高质量人精子分级分离兼容的密度梯度分离方案。

留出30至60分钟的时间使新鲜精液完全液化，然后根据WHO标准（世界卫生组织，2010年）准备用于常规精液分析的样品。在两个重复样本中，至少对100个细胞进行评分，以评估其细胞运动性，生存力和形态（每个重复样本中至少要检查5个显微镜视野）。
在存在Diff- Quik 染色的情况下，使用400 倍放大倍数和明场显微镜，根据WHO标准评估精子形态（世界卫生组织，2010年）。
使用相差显微镜光学系统（放大400倍）评估精子的运动能力，并将细胞分类为运动的（即，精子表现出从快速进行到非渐进的任何形式的运动）或不运动的（世界卫生组织，2010年）。
通过曙红Y排除法评估精子活力（死细胞被曙红Y染成红色）（世界卫生组织，2010年）。
在不连续的Percoll 密度梯度（包括40％和80％的Percoll 悬浮液；配方7）上分馏人类精液样品。
通过使用移液管将3 ml 40％Percoll 添加到15 ml离心管中来组装梯度。然后用3 ml 80％Percoll 覆盖40％的部分（每个精液样品需要一个梯度，应制备并在使用前于37°C保持不超过30分钟，以避免梯度损失）。
40％Percoll 悬浮液顶部的精液样品
使用摆式转子在室温下以500 ×g 离心30 m 。
从80％Percoll 悬浮液的底部收集的精子细胞名义上称为“优质”或“成熟”的精子，而在40/80％Percoll 界面处分配的精子被称为“劣质”的精子。后者的精子群的特征在于功能降低，包括完成顶体胞吐作用的能力受损（Zhou et al。，2017）。因此，从沉淀物中回收前一批优质细胞，并丢弃分配到上清液中的剩余样品。
在5 ml Biggers，Whitten和Whittingham培养基（BWW）（Biggers，1971年）的无容性配方中，将精子沉淀轻轻重悬（配方6和8 ）。
按上述方法重新评估精子运动能力，然后在室温下用旋转转子以500 ×g 离心15分钟，洗涤剩余的细胞。在适合实验要求的培养基中重悬优质精子。
通过稀释固定液（配方4）中的等分试样（1:20）并将其装入改良的Neubauer血细胞计数器的计数室中，评估Percoll 分离后回收的优质精子的总数。在10分钟内评估样品，并确保每个重复至少计数200个精子。计算每个样品中的精子总数（世界卫生组织，2010年）。
注意：如果Percoll 分离后回收的优质精子总数低于2×10 6个细胞的阈值，则该实验不应继续进行。

诱导人类精子获能
要在体外诱导获能，应通过酪氨酸磷酸化状态，透明带结合能力以及重要的是在这些方案的背景下评估，将精子以经优化可诱导人精子获能的BWW制剂（致癌的BWW；配方1和8 ）进行孵育。具有完成顶体反应的能力（Mitchell 等，2007； Redgrove 等，2011）。车辆控制和复制实验管应每个包含大约10×10 6 精子，悬浮在1 ml预热的电容性BWW培养基中。
在5％CO 2 ：95％空气气氛下于37°C孵育精子3 h，每30分钟轻轻颠倒一次，以防止细胞沉降。
注意：孵育期间应松开每个盖子，以利于气体交换。

孵育后，准备精子，以使用以下概述的实验方案评估它们进行顶体反应的能力。

体外刺激顶体胞吐作用
在这里，我们根据Zhou 等人的研究，描述了使用钙离子载体（A23187）或孕激素激发的人精子能力增强人群中顶体胞吐作用的优化方法。（2017年）。虽然A23187和孕激素都是有效的激动剂，能够调节引发此事件所需的胞质Ca 2+ 水平增加，但我们注意到这两种刺激通过不同的机制引起顶体胞吐作用。因此，据报道暴露于孕酮导致离子通道的刺激以及调节顶体反应进程的细胞内信号传导机制和效应子途径的启动。相反，通过直接促进Ca 2+的流入，A23187离子载体具有绕过下游调节途径的潜力，因此相对宽容了裸露的精子的功能状态（Tateno 等人，2013）。由此可见，A23187挑战往往引起顶体反应的更高的速率（〜40 - 50％）比孕酮（〜30 - 40％）（周等人，2017）。从临床角度来看，激动剂反应的这种变化反映在A23187攻击后的顶体反应速率中，与使用孕激素所获得的相比，预测体外受精（IVF）成功率的判别力较低（Krausz 等，1996）。此外，即使在相对较高的浓度下，孕酮的细胞毒性也比A23187小，因此更适合制备与下游临床应用（如显微操作）相容的活的顶体反应的精子（Parinaud 等，1992）。

为了诱导顶体胞吐作用，将获能的人精子在37°C下与1 ml补充有以下任一种的获能BWW一起孵育：
2.5 µM A23187，持续30分钟。需要注意的是中的10mM储备溶液首先1:2稀释，000在获能BWW，然后混合1：1（V / V）与精子。
Ø [R ：

15 µM孕酮* 2小时。请注意，首先将75 mM的储备溶液在电容性BWW中按1：500稀释，然后与精子按1:10（v / v）混合。
Ø [R ：

DMSO载体对照（稀释至与任一种兴奋剂制备所用的浓度相同）。
* N OTE：如果使用孕酮激动剂以诱导顶体的胞吐作用，确保的pH 获能BWW培养基的7.00的范围内的缓冲- 7.05; 通过实验确定其可以诱导人精子中顶体胞吐的最佳水平（Zhou et al。，2017）。如果使用A23187，则无需对电容性BWW介质的pH值进行此类调整。

在适当的诱导期完成后，从每支试管中取出10 µl，以评估精子的活力和生存力，以确保任何一种治疗均不会对它们产生不利影响。
沉淀通过离心精子悬浮液的剩余部分，在500 ×g下在室温下5分钟，在一个固定的转子悬浮之前于500μl的预热低渗肿胀（HOS）MEDI 微米（配方3）和温育额外在37°C下放置30分钟。
注意：HOS测试用于区分顶体反应诱导时存活的细胞（即卷曲的尾巴肿胀）与可能经历过早/自发的垂死/死细胞（即非膨胀的直尾巴）相对的细胞顶体内容物的损失与完成生理顶体反应无关（Jeyendran等，1984）。

在HOS培养基中完成孵育后，通过在固定转子中以500 ×g 离心5分钟来沉淀精子悬浮液，然后将沉淀重新悬浮于500 µl 4％（v / v）多聚甲醛（PFA）溶液中，以固定精子。在室温下10分钟。
如下所述，将PFA 固定的精子重悬并洗涤，以检测顶体胞吐作用。

精子顶体状态评估
顶体胞吐作用的完成可使用组织化学或免疫荧光技术进行评估（Nixon 等，2020），后者依赖于用荧光标记的凝集素（例如，豌豆（Pisum sativum）凝集素（PSA），花生凝集素（（PNA），伴刀豆球蛋白A凝集素（ConA ）]或针对顶体相关抗原的抗体（例如抗CD46，抗anti蛋白抗体）（Aitken和Brindle，1993； Carver-Ward 等，1997； Larson和Miller， 1999）。两种方法都相对简单，可重现，并且产生明显不同的染色模式（图1和2）。

精子顶体的组织化学标记（图1）：
下面我们描述基于考马斯亮蓝G-250的应用以产生富含蛋白质的顶体内容物的强烈标记的简单且快速的单一染色方案（Larson和Miller，1999）。尽管这一单一步骤的方案不能区分活的精子（因此无法完成生理顶体反应），但可以通过与低渗溶胀试验协同进行考马斯蓝标记来实现此目的（Jeyendran 等，1984 ）。，其原理如上所述。尽管组织化学技术可能缺乏使用荧光团缀合的凝集素获得的固有灵敏度，但它们仍具有多个优点，包括它们相对便宜且易于执行，利用稳定的色斑（从而避免了光漂白和信号强度降低的问题）。荧光试剂常用），并且可以使用标准光学显微镜轻松观察标记的精子；临床实验室通常可以使用的基础设施（与昂贵的专业荧光仪器相对）。

通过在室温下离心洗涤PFA固定的精子两次，并重悬于100 mM醋酸铵（pH 9.0）中。简短地说，将精子悬浮液在固定转子中以500 ×g 离心5分钟。小心抽吸并弃除20-40 µl上清液。通过轻轻移液将精子沉淀和剩余的上清液重悬在1.5 ml 100 mM醋酸铵中。重复洗涤程序。
将所得的精子沉淀重悬于1 ml 100 mM醋酸铵中，然后使用另一个载玻片将50μl 此精子悬浮液涂在载玻片上。简要地，使用干净的载玻片以45°角将精子悬浮液滴拉过载玻片的表面。该技术应在1 s内完成，以确保涂片变薄并均匀地分布在整个滑动表面上。
通过相差显微镜（×400）检查湿涂片，以确保精子均匀分布在载玻片上而不会结块。
允许的幻灯片，以彻底风干。大约15分钟就足够了，但在此步骤中，幻灯片可能会留过夜。
沉浸精子涂片小号在新鲜制备的考马斯蓝染色（配方2 ）孵育在室温下进行2分钟。
在空气干燥之前（〜15分钟），用蒸馏水彻底清洗载玻片以去除多余的污渍。安装在用20的干燥，染色载玻片上的盖玻片微升DPX 封固。允许DPX 封固MEDI 微米至干completel Y（〜30分钟），过量可通过印迹除去所述与组织滑动。
在油浸式明场光学显微镜下以1,000倍的放大倍率观察载玻片，并评估染色的精子中可存活的顶体反应细胞的百分比；为了达到可接受的低抽样误差评估最小200个细胞中随机选择的视野的（见数据一个下面nalysis）。
精子顶体的免疫荧光标记（图2）：
驻留在顶体基质和人精子的外顶体膜结合糖可以通过标记被可靠地和灵敏地检测用荧光缀合凝集素[ 即，豌豆凝集素（PSA）和花生。花生（花生）凝集素（PNA），分别] （Aitken的和Brindle ，1993）。虽然既不凝集素是能够区分活精子（因此生理顶体反应的完成）的，该目的可以通过在音乐会与低渗肿胀试验进行免疫荧光标记来实现（Jeyendran 等人，1984 ），的原理如上所述。然后，使用荧光偶联探针检测顶体状态的主要优势在于其固有的特异性和灵敏度，即使在低浓度下也是如此。后者归因于高信噪比。此外，多种不同的荧光团的可用性提供了进行多重分析的机会，从而可以在单个精子样品中同时观察到几个分子（Zhou 等人，2017； Gaikwad 等人，2019）。

通过离心（在固定转子中于室温下500 ×g 于室温下洗涤5分钟）洗涤PFA固定的精子两次，并在室温下重悬于在1 ×磷酸盐缓冲盐水（PBS; pH 7.4）中制备的0.05 M甘氨酸中以消除未还原的醛。精子可在此步骤中于4°C保存或立即处理。
在适当时，等分试样10 微升固定精子悬浮液的成12的孔- 孔玻璃显微镜载玻片上。
用相差显微镜（×400）检查湿玻片，以确保精子均匀分布在每个孔中而不会结块。
让幻灯片彻底风干幻灯片。大约15分钟就足够了，但否则可以将玻片放置过夜。
通过将样品浸入冰冷的甲醇液滴中并在室温下孵育10分钟来使精子透化。将玻片放置在密封的加湿室中（通过在塑料容器的底部衬上湿纸巾而制成），以保持透湿持续时间，以免干燥。
将玻片与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的PSA（10 µg / µl）在37°C下孵育30分钟。为了控制精子和/或凝集素自发荧光的可能性，请使用阴性对照治疗，其中将精子与非结合的PSA（10 µg / µl）在37°C下孵育30分钟。该处理应不产生/最小限度的荧光标记。
在室温下使用1x PBS彻底清洗载玻片3次，以去除多余的污渍，然后再将其安装在Mowiol中（配方5）并盖上盖玻片。
观察使用滑动荧光显微镜（蔡司Axio上成像仪A1）（见数据一个下面nalysis）。注意，用于激发和发射的显微滤光片的波长分别为475 nm和〜524 nm。评估染色的精子中可存活的顶体反应细胞的百分比；为了达到可接受的低抽样误差评估最小200个细胞中随机选择的视野的（见数据一个下面nalysis）。

数据分析

精子顶体状态的评估：人精子的顶体状态可以根据囊状帽状结构中包裹的脂质体的染色进行分类，该结构覆盖在精子头部的前三分之二上。具体而言，保留了顶体的那些未反应的精子在整个顶体帽结构域中均显示出强烈，均匀的标记。

的精子的活力评估：一个HOS测试的包含使得能够与完整膜（精子的判别，即，重要的）在从那些具有受损膜（顶体反应的诱导的时间即可能已经经历过早/，垂死/死亡细胞）顶体内容物的自发损失与完成生理顶体反应无关（Jeyendran 等，1984）。具体而言，在HOS培养基中孵育会导致细胞内大量肿胀，从而改变具有完整膜的重要细胞的血丝，从而导致尾巴弯曲。在这个实验中，所有形式的盘绕TA ILS被评定为活精子。

在实验室计数器的帮助下，统计每个顶体类别（完整的顶体和顶体发生反应）中重要精子的数量。如上所述，建议每次重复评估200个精子，以达到可接受的低抽样误差。然后以活体顶体反应的精子的平均百分比报告数据。注意到预计顶体反应的总体速率会根据精子质量而变化，WHO认可的标准为区分正常的顶体胞吐速率提供了有价值的参考（世界卫生组织，2010年）。因此，在正常精子样品中，媒介物对照（DMSO）与A23187 /孕激素诱导的顶体反应速率之间的预期差异约为15％。相比之下，媒介物对照和经A23187 /孕酮处理的细胞之间的顶体反应率差异低于10％被认为是异常的，而介于10％-15％之间的值表明精子功能可能异常。在类似的情况下，高于15％的媒介物控制值通常指示自发和/或过早的顶体反应。

精子顶体的组织化学标记：预期有四种模式的精子标记（图s 1B，C），其解释为：
具有顶体反应的重要精子=浅蓝色/顶体域清晰，尾巴卷曲。
具有完整顶体的重要精子=深蓝色顶体结构域，尾巴卷曲。
死亡的精子，顶体反应=浅蓝色/透明的顶体结构域，尾巴直。
具有完整顶体的死精子=深蓝色顶体结构域，尾巴直。

D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 2003097--1443 Brett Nixon 846985 \ Figs jpg \图1.jpg

图1. 精子顶体的组织化学标记。一。示出用于利用考马斯工作流程示意图乙LUE G-250 的精子顶体的标记。乙。代表性图片。Ç 。Ç orresponding描绘后检测到的四类人类精子的示意图考马斯蓝G-250 进行低渗肿胀试验细胞的标记。生命的（活的）精子是根据尾巴紧缩而鉴定的，而非生命的（死的）精子则是尾巴直的。具有完整顶体的精子在精子头部的顶端区域具有强烈的深蓝色标记，而那些通过生理性（活细胞）或退化性（死细胞）顶体反应而失去顶体成分的精子以亮光来区分。顶端蓝色/未染色。比例尺s = 10 µm 。

2. 精子顶体的免疫荧光标记：预期有四种模式的精子标记（图2），其解释为：

有顶体反应的重要精子=顶体区域内无荧光染色的精子，或限制在赤道段的绿色荧光带以及尾巴卷曲。
重要精子与顶体完整=精子，其中超过一半的头是明亮并且均匀地显示终端AY 荷兰国际集团的绿色荧光和卷曲的尾巴。
死亡的精子与顶体反应=顶体区域内无荧光染色的精子，或限于赤道段的绿色荧光带和直尾。
死精子与顶体完整=精子，其中超过一半的头是明亮地且均匀地显示荷兰国际集团的绿色荧光和直尾。

D：\ Reformatting \ 2020-5-6 \ 2003097--1443 Brett Nixon 846985 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 精子顶体的免疫荧光标记。一。示意图示出了用于利用该工作流的FITC缀合的PSA 升abeling精子顶体。乙。代表性图片。Ç 。Ç orresponding描绘经受低渗肿胀试验细胞的FITC缀合的PSA标记后检测到四类人类精子的示意图。至关重要的（活）spe rmatozoa是根据紧密卷曲的尾巴鉴定的，而非关键（死）细胞则具有直尾巴。具有完整顶体的精子在精子顶部区域具有明亮而均匀的绿色荧光标记，而那些通过生理性（活细胞）或退化性（死细胞）顶体反应而失去顶体成分的精子具有以下特征：要么在顶体区域内没有荧光染色，要么是限制在赤道段的绿色荧光带（未显示）。比例尺s = 10 µm 。

笔记

我们注意到，虽然使用FITC结合的PSA和PNA凝集素评估人精子顶体状态可以获得可比的结果，但根据我们的经验，后者会产生更多可变的结果，包括顶体标记的强度和均匀性不一致。因此，我们谨慎地建议使用FITC偶联的PSA，而不是PNA，因为稳健的标记模式PSA产生的结果有助于其获得更一致的解释，尤其是对于那些不熟悉顶体标记评估的人们。

菜谱

电容性BWW（用于50 ml工作溶液）
称量干燥成分：
105 mg NaHCO 3
50 mg D-葡萄糖
50 mg PVA（代替BSA）
用BWW储备溶液补足45毫升（配方8）
添加液体：
0.5 ml青霉素-链霉素
1 ml HEPES缓冲液
50 µl丙酮酸钠
180 µl 乳酸钠（该溶液非常粘稠；为确保准确分配，请使用20至200 µl Finnpipette 添加该成分，并在中途切开尖端，以增加孔径并缓慢吸出液体）
使用BWW储备液将最终体积调整为50 ml
检查最终渗透压在290-310 mOsm / kg 的范围内
加入3 mM己酮可可碱（ptx ）和5 mM二丁酰基环磷酸腺苷（dcAMP ）
注意：虽然BWW的大量MEDI 嗯可以每天制备（50 - 100毫升）中，添加3mM的的PTX 和5mM dcAMP 只有经过发生ssessing高质量人类精子的总数和确定适当的体积的稀释所需的电容性BWW数量。此预防措施旨在最大程度地减少ptx 和dbcAMP 的使用，后者是一种特别昂贵的试剂。

考马斯蓝染色
0.22％（w / v）考马斯亮蓝G-250

50％（v / v）甲醇

10％（v / v）冰醋酸

40％（v / v）无菌过滤水

居屋中等
0.735 克柠檬酸钠

1.351 克果糖

补足到100毫升，无菌过滤笏ER （重量克分子渗透压浓度应接近155 mosmol /公斤）。分装并保存在-20 °C。使用前预热至37 °C。

稀释精液的固定剂
将5 g的碳酸氢钠（NaHCO 3 ）和1 ml的37％（v / v）甲醛溶于100 ml的纯净水中
储存在4℃。如果溶液中形成晶体，请在使用前使其通过0.45 µm过滤器
Mowiol 安装解决方案
6 g甘油，2.4 g mowiol ，搅拌混合
在室温下搅拌2小时的同时添加6 ml H 2 O
加入12 ml 0.2 M Tris（pH 8.5），然后在60°C加热10分钟以溶解Mowiol （如有必要，可以重复此操作直到Mowiol 完全溶解）
加入2.5％（w / v）DABCO，并在旋转转子中以5,000 ×g 离心15分钟，以沉淀任何不溶的固体
吸出上清液并以1 ml等份冷冻
无电容BWW（用于50 ml工作溶液）
称量干燥成分：
73 mg NaCl
50 mg D- g 葡萄糖
50 mg PVA（代替BSA）
用BWW储备溶液补足45毫升（配方8）
添加液体：
0.5 ml青霉素-链霉素
1 ml HEPES
50 µl丙酮酸钠
180 µl 乳酸钠（该溶液非常粘稠；为确保准确分配，请使用20至200 µl Finnpipette 添加该成分，中途切开尖端以增加孔径直径并缓慢吸出液体）
使用BWW库存将最终体积调整为5000万升
检查最终渗透压在290-310 mOsm / kg 的范围内。注意：应每天使无电容和电容BWW溶液新鲜。
Perc oll 工作液（用于50 ml 100％的原液）
5 ml 10×Ham's F-10营养混合物，50 µl 丙酮酸钠，180 µl 乳酸钠，50 mg PVA，105 mg NaHCO 3 ，用Percoll 补充至50 ml
用非电容性BWW稀释至包含40％或80％Percoll的工作溶液
准备和使用新鲜
BWW储备溶液（用于1 L ）
称量干成分：
5.54克氯化钠

356 mg KCl
250 mg CaCl 2 · 2H 2 O

162毫克KH 2 PO 4
294毫克MgSO 4 ·7H 2 O

用无菌过滤水补足1 L ，等待粉末溶解
检查渗透压约为190 mOsm / kg
注意：准备后，BWW原料可以在4°C下保存3个月。

致谢

该手稿中描述的实验程序的优化最初在Zhou 等人中进行了描述。（2017年）。这项研究得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）项目拨款（APP1103176）的支持，授予BNSLC是纽卡斯尔大学研究生研究奖学金的获得者，而BN是NHMRC高级研究奖学金（APP1154837）的获得者。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。

伦理

在这个手稿中描述的实验过程从健康的面板与知情同意书获得的人类精液样本优化的正常精子症在纽卡斯尔，澳大利亚新南威尔士州大学组装生殖科技集团的捐助者。所有实验均按照纽卡斯尔大学人类研究与道德委员会批准的实验方案（批准的实验方案编号：H-2013-013 9 ；有效期：2013-2020 ）进行。

参考资料

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2. Aitken，RJ和Nixon，B.（2013）。精子获能：一望无际的远景。Mol Hum Reprod 19（12）：785-793。

3. Barros，C.，Bedford，JM，Franklin，LE和Austin，CR（1967）。膜囊泡化是哺乳动物顶体反应的特征。细胞生物学杂志34（3）：C1-5。

4. Biggers，JD（1971）。小鼠胚胎的代谢。Ĵ 生殖体外受精增刊14：41-54。

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