材料和试剂

1. 滤纸（Fisherbrand，目录号：05-714-4）

2. 带橡胶头的锤子（Graham Field，目录号：1312-1）

3. 好夏比

4. 1.5毫升试管（美国科学，目录号：1615-5510）

5. 解剖井盘/Pyrex斑点板（Fisher Scientific，目录号：13-748B）

6. Dumont Fine#55镊子（精细工具，目录号：11295-51）

7. 盖玻片（Fisherbrand，目录号：12-542A）

8. 科普林罐（VWR，目录号：74830-150）

9. 湿度箱（如Pyrex盖玻璃烤盘）

10. 聚赖氨酸处理的载玻片（Polysciences，目录号：22247）

11. 聚赖氨酸（上述预处理载玻片的替代品）（Sigma-Aldrich，目录号：P8920-100 ml）

12. 西格玛科特（Sigma-Aldrich，目录号：SL2-100ML）

13. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）试剂：

a、 NaCl（Fisher，目录号：BP358-212）

b、 KCl（费希尔，目录号：BP366-500）

c、 Na2HPO4（西格玛，目录号：S3264-500G）

d、 KH2PO4（西格玛，目录号：P9791-1KG）

14. 使用的主要抗体：抗LacI（Rockland，目录号：600-401-B05）、抗Nup98（Capelson等人，2010年）、抗Brm（Nakayama等人，2012年）

15. 吐温20（费希尔，目录号：BP337-500）

16. 冰醋酸（Fisher，目录号：BP2401-212）

17. 16%多聚甲醛（PFA）（Alfa Aesar，目录号：43368）

18. 液氮

19. Kimwipes或其他纸巾式雨刷器（Fisher Scientific，产品目录号：06-666A）

20. 荧光二级抗体（如Thermo Fisher，目录号：A-11004）

21. Hoechst 33342（赛默飞世尔，目录号：H3570）（10毫克/毫升储备）

22. 延长金防褪色（赛默飞世尔，产品编号：P36930）

23. PBS（见配方）

24. PBST（见配方）

25. 固色液（见配方）

26. 45%醋酸（见配方）

27. 阻断液/抗体鸡尾酒碱（见配方）

设备

1. 镊子

2. 微量加样器

3. 化学气罩

4. 解剖显微镜（如徕卡，型号：徕卡S6E）

5. 细胞培养/相差显微镜（如徕卡，型号：徕卡DM IL）

6. 宽场荧光显微镜（如徕卡，型号：徕卡DM6000）和/或激光扫描共焦显微镜

7. （可选）轨道振动筛（VWR，目录编号：12620-938)

软件

1. MATLAB（许可证）（分析必需）

2. 绘图/统计分析软件，如Excel、Prism（许可证）（分析所需）

三。（可选）ImageJ（免费）三。（可选）ImageJ（免费）

程序

A、预先制备Sigmacote处理过的盖玻片和聚赖氨酸处理的载玻片

为了防止染色体贴壁和多聚赖氨酸染色玻片的附着，应注意：为了防止染色体的粘连，应优先使用聚赖氨酸处理过的玻片。最好在实验前处理。

Sigmacote处理的盖玻片

1. 将一个1.5毫升的管架（或类似结构）用塑料包装起来，放在一个更大的矩形纸巾上，放在一个化学品罩中，见图1。

2. 将Sigmacote（储存在4°C）倒入Sigmacote瓶盖。

3. 使用干净、精细的镊子，将盖滑片单独浸入Sigmacote中，完全浸没。最好使用弯曲/弯曲的尖端，这样镊子就可以最小限度地接触到盖玻片（参见下面的步骤B7）。

4. 立即取下盖玻片，将盖玻片的一角接触到Sigmacote瓶盖中的液体表面，以除去多余的液体，并将盖玻片以约60°的角度放置在纸巾顶部的塑料覆盖架上，以使任何剩余的Sigmacote灯芯远离盖玻片（见图1）。

5. 完成所需数量的盖玻片后，将Sigmacote从瓶盖中放回Sigmacote瓶中，在4°C下储存，在1年内使用。

6. 将盖玻片放在化学品罩中晾干一夜（如果时间有限，可在约1小时后使用）。

7. 将盖玻片存放在4°C的环境中（隔夜干燥后再放回原容器即可），最好在2个月内使用。

图1。一个简单的实验室装置，用于干燥Sigmacote处理后的盖玻片。如上文A1-A4所述，将用于多线染色体压片的盖玻片用Sigmacote处理，并靠在塑料包装的1.5毫升管架上，放在纸巾上，放在化学品罩内。

聚赖氨酸处理的载玻片

可购买经预处理的聚赖氨酸载玻片（我们发现，与自处理的载玻片相比，经预处理的载玻片具有更低的自荧光背景），但为了节省成本，或者如果无法获得预处理的载玻片，则可使用聚L-赖氨酸处理标准磨砂显微镜载玻片，其处理方式与使用Sigmocote处理的盖玻片类似：

1. 将聚L-赖氨酸倒入一个玻璃Coplin罐中。

2. 插入磨砂显微镜载玻片，使载玻片的非磨砂玻璃部分（即，不包括磨砂标签区域）浸没在聚赖氨酸中。

3. 一旦Coplin罐装满载玻片，按处理时的原始顺序取出载玻片，并与纸巾上的垂直面（如锥形架）成~60°角。

4. 让载玻片干燥一夜，如有需要，至少2小时。

5. 储存在4°C下（隔夜干燥后可放回原滑箱中），最好在2个月内使用。

B、腺体切割和染色体压扁

在开始解剖之前，收集所有材料，制作固定溶液，并在适当的容器中填充液氮。

1. 挑选理想的3龄游荡幼虫，并将最多4只放入PBS中的玻璃分离井盘中。

注：挑选幼虫是获得最高质量南瓜最重要的一步！用于收集唾液腺的3龄游荡幼虫应为：

a。不拥挤的瓶子/瓶子–理想的幼虫对营养素的竞争很低，而且又肥又健康。

b。晚游荡3龄，最小移动，但还没有在前蛹阶段，因为较老的幼虫（主要只移动嘴）将有更大的染色体和最好的南瓜。

（一）仍在瓶/瓶壁上快速移动的幼虫将更年轻，多线染色体复制较少，因此染色体更小。

（二）然而，太接近化蛹期/蛹前期的幼虫会产生过多的唾液腺“胶”蛋白，这会导致扩散困难和免疫荧光背景增强。为了避免这种情况，大的“玻璃状”或更透明的唾液腺（其中充满了刺穿时释放的胶状物质），（见图2）应该跳过，以获得最佳质量的南瓜。不要吃前呼吸孔延长的幼虫，因为它们几乎总是有这种类型的腺体。

c。从游荡幼虫的第一波开始，通常在小瓶/杂交体建立或翻转后6-7天出现（如果在21-22日饲养摄氏度室温）。

优质南瓜可以来自在无拥挤条件下游荡第二天的幼虫，但是唾液腺和染色体通常是第一波幼虫最大的，所以成功率/质量将从第一波幼虫中最高。

d。女性（除非对性别差异感兴趣）。雌性幼虫的唾液腺和多线染色体往往比雄性幼虫大。3龄幼虫的雌性性别是由幼虫内部两侧（距幼虫后端约1/3）看不到大而透明的球形性腺而决定的。这些大的性腺代表男性。

图2。从3龄游荡幼虫中分离出不同类型的唾液腺。 A、典型的一组唾液腺，外观通常不透明/乳白色，可见清晰的细胞。B、成熟腺体应避免，取自接近化蛹期的幼虫，由于粘着物质增加，通常细胞边界不太明显，因此显得更加清晰/透明/“玻璃状”。附着在腺体上的白色碎片是剩余的脂肪体。

2. 将一只幼虫转移到带PBS的新井中进行解剖。每2-3次解剖后，更换该井的PBS。

3. 用一把钳子抓住幼虫的口钩，用另一把钳子从身体的一半左右轻轻地向另一个方向拉动幼虫，以此来解剖唾液腺。（为了演示果蝇幼虫唾液腺的解剖，这里有很多公开视频）

4. 从腺体侧面剥下脂肪体（白色组织条），因为这有助于下游成像中的荧光背景；但是，如果这些脂肪体持续存在，则不要花费超过几分钟的时间移除这些脂肪体，最好尽快进行固定。在固定前解剖不应超过5分钟。

5. 将腺体转移到另一个含有~100-200μl新制固定液的分离皿中，静置1分钟。

a、腺体可以由“叉形骨”或茎干区固定，因为这样可以防止损坏腺体细胞。

b、使用一对带有弯曲/弯曲尖端的镊子（如下面的步骤B7所述）可以更容易地将腺体转移到这里。

c、醋酸在这里起到破坏核膜和帮助染色体扩散的作用，但是并不是所有抗体在这些条件下都能很好地工作，有些抗体可能需要在不同的固定长度或溶液中进行优化，见c节中的注释。

注意s:

a。在我们手中，所有的醋酸溶液必须每30-45分钟用100%的醋酸制成新鲜溶液，以确保染色体的正确传播，因为醋酸稀释液很快变质，会使染色体更难传播。

b。另外，一旦打开，16%的PFA必须在4℃下保存（通常从玻璃安瓿转移到15ml锥形管中），并且仅使用3周，以获得最佳染色体扩散和结构保存。

6. 重要！从这一点开始，迅速而小心地进行固定，直到玻片在液氮中冻结（下图）。在上述固定培养期间，最好准备好盖玻片并贴上标签。

7. 用kimwipe或其他纸巾擦拭Sigmocote处理过的盖玻片上的残留物，在盖玻片上加入7μl新鲜的45%乙酸，然后轻轻地将脆弱的腺体转移到乙酸滴中。

a、腺体在固定后变得异常脆弱，需要巧妙地转移。

b、因为这个步骤是一对镊子，一个弯曲的尖端，这样它在面向另一个尖端的末端形成一个弯曲或钩状的形状，防止镊子完全闭合。它们可以在顶端的一小滴液体中拾起腺体，防止腺体被挤压和粘在镊子上。这些可以用于所有的转移步骤，但在固定后当腺体变得脆弱时尤其必要。强烈推荐

8. 将经聚赖氨酸处理的载玻片轻轻放在乙酸滴上，使腺体大约在载玻片的中间。

9. 翻转载玻片，用戴手套的食指在盖玻片上施加压力，同时将盖玻片“推入”载玻片，同时将盖玻片以顺时针方向旋转约1厘米的圆圈，绕3圈，分裂组织，扩散细胞和染色体（步骤B9-B14见视频1）。

a、重要的是始终在一个方向上绕一个圈，以防止染色体缠结。

b、盖玻片滑动应相对平稳，不会卡住。如果发生卡滞，请参阅以下注释。

c、这一步需要优化和练习，让每个人学会适当的动作和手指的压力，以获得最佳的伸展。图3A显示了当这个步骤需要更多压力时染色体的样子。

注：移动盖玻片的目的是充分分离细胞，使它们不重叠，使细胞膜破裂，并使染色体扩散，但在足够小的区域内，所有染色体仍能被盖玻片覆盖，以便以后安装和成像。如果盖玻片在扩散过程中滑动不顺畅，这将导致染色体撕裂/拉伸（图3B）。然而，阻力太小，细胞就不会断裂，染色体也不会充分扩散（图3A），这可能是由于盖玻片和玻片之间的液体过多造成的。

有助于防止封面纸粘住的措施：

a。避免使用透明的“胶状”压盖（如上步骤B1中所述，这些压盖呈玻璃状/透明状）（见图2）。

b。使用新制的、完全干燥（最好隔夜）并完全擦掉Sigmacote处理过的盖玻片，使用新鲜的Sigmacote制成（如果您自己处理，也适用于聚赖氨酸处理的玻片）。

c。使用30-45分钟内制备的新鲜醋酸溶液。

视频1。多线染色体南瓜

10. 翻转载玻片，使盖玻片在底部，然后小心地将玻片插入一张折叠的厚滤纸中。

11. 用两个手指握住滑动盖所在位置的两侧，以固定滑块并防止滑块和滑动盖之间发生横向移动。

12. 用橡胶锤以中等力度敲击盖滑动区域约30次。这一步需要练习，所用的力需要针对每个人进行优化。

13. 直接向下推载玻片，将两个拇指牢牢地放在盖玻片的两侧，不要让盖玻片相对于载玻片滑动（见视频1），以便在成像时使染色体变平并防止3D/失焦染色体结构（图3A和3C）。

14. 从滤纸上取下载玻片，并在玻片背面用精细的锐利标记盖玻片角落的位置，以便在将来的抗体培养和安装中定位染色体区域。

15. 在细胞培养/相差显微镜下，在20倍或40倍物镜下检查染色体的传播质量。如果展开令人满意（图3D-3E），则继续。否则，将载玻片扔掉，对下一个幼虫重复，确保每2-3个幼虫都能很好地改变解剖中的PBS。

注：染色体扩散的质量控制：

a。一个好的染色体传播应该有ch呈扇形散开、有点分离、完好无损、未拉伸/撕裂且平坦（图3D-E）。

b。如果幻灯片显示大部分染色体撕裂/拉伸（图3B），染色体非常缠结在一起（图A-B），或细胞核没有充分断裂，染色体仍在一个紧密的球体中（图3A），通常很难从这些数据中获得有用的数据，并且继续进行不合标准的幻灯片通常是浪费时间和资源。

c。有了这个方案，一旦有人实践，我们通常有一个更高的成功率比以前尝试的方案，高达80-90%的经验，从理想的幼虫开始。但是，在这一阶段，您仍然可以扔掉几张幻灯片。由于压片和染色的固有变异性，您希望每种情况（基因型/抗体等）至少有3张高质量的玻片。

图3。染色体质量差的南瓜。 A、扩散不足的南瓜，明显表现为缺乏从原始圆形核形状向外扩散的染色体；扁平化程度较低的南瓜，明显表现为存在于多个焦平面中的染色体，即同时可见模糊和聚焦的染色体。常见方法：为了增加染色体的扩散，在步骤B9中的盖玻片移动过程中必须使用更大的压力；为了减少“模糊度”，请确保在步骤B13中以更大的压力将盖玻片推入载玻片（避免盖玻片相对于载玻片的侧向移动）。比例尺=10μm。染色体被Hoechst染色（显示为白色），在A-E.B.过度伸展的染色体上，可见染色质带清晰的细链。染色质也会在某些地方分裂，没有带出现在他们的定型，有组织的秩序。常见解决方法：在步骤B12中，用锤子轻敲滑块，同时确保在整个挤压和染色过程中，从锤击到最终的盖滑安装，都要避免盖卡瓦相对于滑块的任何横向移动。比例尺=10μm.C.分布良好，但在扁平染色体下方，可见于多个焦平面中的染色体，即同时可见模糊和聚焦的染色体。常见修复：参见图3A“模糊”图例。比例尺=10μm。D-E。理想压片。其特征包括：在同一焦平面上都可见扁平染色体，染色体彼此间的扩散很好，染色体末端常可见，便于识别/细胞学作图；但染色体不会过度伸展，在整个扩散过程中，其厚度/宽度大致均匀。比例尺=10μm.F。理想的挤压和染色。与LacchSO结合位点的蓝染色（p96c）和LachsO-96位点结合的蓝染色（p96c）和LachsO-2010中的蓝染色（p96c）。比例尺=10μm。

16. 如果南瓜的质量很好，继续将载玻片浸入液氮中，同时用大钝镊子（不是细解剖钳）固定载玻片。

a、等到液氮中的灰化/沸腾停止，然后取下滑块。

b、小心地用剃须刀将盖玻片掀开，注意不要将剃须刀滑入含有染色体的区域太远，因为它们可能会从玻片上刮下。

17. 立即将载玻片放入装有洗涤液的Coplin罐中。

a、在此步骤中收集多张幻灯片。

b、如果由于基因型出现时间的不同而不能在同一天采集所有幼虫，则可以将载玻片放在PBS中的Coplin罐中，在4°C下放置过夜（这似乎与大多数抗体兼容）。

18. 所有载玻片解剖压碎后，在封闭液中孵育30-60分钟。

a、这可以通过在装有载玻片的Coplin罐中用洗涤液换成50毫升的封闭溶液，或以与抗体鸡尾酒相同的方式将封闭溶液直接添加到载玻片中，如下文所述（如果试图保存牛血清白蛋白，或在含有贵重试剂的不同封闭条件下进行试验等）

b、如有必要，优化不同抗体的阻断时间。

c、不建议隔夜封闭，如果需要在抗体治疗前过夜储存载玻片，则最好在PBS的前一步停止，不使用吐温，如上所述。

C、初级抗体治疗

1. 从Coplin罐中收集阻断液，制成下一步的一级抗体鸡尾酒（或新鲜使用），并在1.5 ml试管中4℃保存1ml（或更多，如有必要）作为第二天的二级抗体鸡尾酒。

2. 制备抗体鸡尾酒，每个玻片使用30μl（并制作足够多的一个玻片以说明移液不准确），一级抗体通常从阻断溶液中的1/100（体积/体积）稀释开始。

a、多线染色体扩散的抗体稀释液通常比免疫印迹稀释液浓度高10倍。

b、特别弱或强抗体的极端稀释可分别达到1/20或1/500。

c、如果有许多非特异性带间信号，尝试稀释抗体。

d、如果使用不同大小的盖玻片，则需要调整抗体鸡尾酒和其他体积。

笔记：

一。标准固定溶液中的固定时间在30-120秒之间变化，如果固定1分钟导致抗体染色不充分，则可能需要优化。

二。对于某些抗体，尤其是针对通过这种基于乙酸的固定方法从染色质中提取的抗原的抗体（例如组蛋白），可能需要不同的固定策略以更好地保存目标表位，例如：

（一）腺体首先在2%PFA中预先固定30秒。

（二）然后将腺体转移到2%PFA/45%乙酸中2分钟。

（三）如前所述，在一滴45%的醋酸中挤压/扩散腺体。

（四）在液氮中冷冻载玻片并取下盖玻片后，将其直接放入-20°C的70%冷乙醇中至少30分钟。

对于许多抗体，腺体可以在乙醇中过夜，染色不会受到影响。

（五）收集所有载玻片并在乙醇中放置至少30分钟后，在室温下用PBST清洗两次，以完全去除乙醇并继续正常染色。

（六）这些步骤的时间，以及溶液强度，可能需要针对各种抗体进行优化。

3. 从Coplin罐中取出载玻片，使用kimwipe或其他纸巾式擦拭器小心地从sharpie轮廓方格外的载玻片上去除多余的PBST，并用吸管将30μl抗体鸡尾酒移到轮廓区域。

4. 使用一对细镊子小心地将未经处理的盖玻片降到含有抗体混合物的轮廓区域，从覆盖片开始，在轮廓区域的一个边缘处形成一个角度，然后慢慢降低/压平盖玻片，避免产生气泡。

5. 将玻片轻轻地放在稍湿（但不是浸湿）的纸巾上，放在密闭的湿度室中。

6. 一旦所有载玻片都用一级抗体处理过，用盖玻片盖住，并放置在湿度室中，小心地关闭密封室，轻轻地将其放置在4°C的平坦、不受干扰的地方过夜。

a、应不惜一切代价避免组织干燥，因为它会导致高背景和不良染色。

b、有些抗体可以在室温下孵育3小时，而不是在4℃过夜。

D、洗涤及二次抗体治疗

1. 用戴手套的手指沿与载玻片平行的方向轻轻移动，小心地从载玻片上滑出玻片，并将玻片放入装有洗涤液的科普林罐中清洗。

注：如果盖玻片不容易滑动，摩擦力和作用力最小，抗体混合物可能已经干透，该载玻片可能不可用，所以成像时请注意并与其他玻片在相同条件下进行比较，以确保质量。

2. 在洗涤液中清洗载玻片10分钟，3次，要么静止在工作台上，要么以100转/分的速度在轨道摇床上轻轻混合。

3. 以与初级抗体相同的方式引入荧光结合的二级抗体（1/300是一个很好的工作稀释液，根据需要进行调整），在封闭的湿度室中在室温下黑暗中培养1h（一个抽屉可以很好地工作，只需缓慢地关闭和打开）。

E、 Hoechst/DAPI处理和盖板安装

1. 小心地取下盖玻片，并在黑暗中用洗涤液3 x 10分钟再次清洗载玻片。

2. 用Hoechst或DAPI（PBS中的1/1000）对载玻片进行染色2分钟，方法是在轮廓区域添加100L的Hoechst/PBS鸡尾酒（不要用盖玻片盖住），并保护载玻片不受光照，例如用内衬箔纸的管架盖覆盖。μ

3. 将载玻片放入PBS中，在黑暗中洗涤10分钟。

4. 用抹布从每个载玻片的轮廓区域去除多余的液体，并在轮廓区域的一个象限中添加5-10μl长效金防褪色剂（或类似的安装介质）。

5. 小心地将未经处理的盖玻片放在轮廓区域，并通过倾斜盖玻片使其首先与安装介质接触象限，然后慢慢降低到轮廓区域的其余部分，直到其变平，从而避免产生气泡。

6. 小心地将指甲油放在盖玻片的角上以固定滑片，盖住盖玻片，并等待~5分钟使指甲油变干。

注意：在这一阶段，或在染色体固定和快速冷冻后的任何时候，盖片的任何用力移动都会导致染色体拉伸和撕裂，应不惜一切代价避免.

7. 当盖玻片拐角处的指甲油干燥且不移动时，小心地用指甲油沿边缘将盖玻片完全密封。

注意：如果时间不是问题，让滑块干燥30分钟将允许安装介质（如果是硬化介质）干燥，并使盖滑片在完全密封之前更加牢固。

8. 让指甲油干燥至少10分钟（覆盖），然后继续成像，或在4°C下储存。

9. 如果在一周内成像，载玻片的质量最好（有些抗体会持续更长时间，但次级抗体的荧光信号会随着时间的推移而减弱）。

F、成像

1. 图像幻灯片使用60倍物镜获得大视场，或使用100倍物镜（1.6倍放大倍率）实现最大变焦，使用的曝光水平或激光强度足够低，没有通道被过度曝光，但最亮的像素仍然明亮。

2. 在相同的采集条件下对所有幻灯片进行成像，这是通过在最亮的样本上设置成像设置来确定的。

3. 在宽视场显微镜上成像对大多数目的来说是足够的，并且比使用激光扫描共焦显微镜更不容易使样品发生光漂白；然而，精细的染色质结构以及来自一些较弱抗体的信号，使用共焦成像能更好地分辨。

4. 每张幻灯片收集10+组不同染色体的图像，每个条件/基因型收集3张幻灯片。

5. 如果以.lif（Leica）或.czi（蔡司）等专有格式保存文件，请确保在使用ImageJ等程序在MATLAB中进行分析之前分割通道并保存为tiff文件。

注：否则，在结束图像采集之前，请直接使用图像采集软件将tiff图像保存为单独的通道。

数据分析

这里我们介绍了运行定制的MATLAB程序PCCcalc（see）来分析荧光强度相关性的说明。该程序以像素为基础计算染色体压片的三个通道图像中每对通道之间的皮尔逊相关系数（PCC）。在这些例子中，通道是Hoechst（或DAPI），单个lacO整合位点处的LacI栓系蛋白质（“测试员”通道）和代表蛋白质或复合物的“目标”通道，其在lacO整合位点的富集正在被评估（图3F）。LacI栓系蛋白在多线染色体上形成一条明亮的带。PCCcalc使用LacI信号创建一个阈值图像掩码。由掩模定义的像素用于评估荧光强度的相关性。作为示例使用的复合图像的各个通道的文件/图像包括为，[它们是带有Hoechst（蓝色）、Lac-I（绿色）和Brm（红色，最初在中山等人中描述）的免疫荧光染色的图像。，2012年）输入到MATLAB的PCCcalc函数中，以遵循本节中引用的协议。补充文件1补充文件234

PCCcalc被设计成可以由新手执行。它可用于测量任何三通道数据中的强度相关性，其中覆盖感兴趣区域的掩模可以由测试器图像中的单个阈值强度定义。当前代码包括使用DAPI/Hoechst通道来定义掩模，以防检测仪信号从染色质中散开/跨越多个频带。

1. 将PCCcalc文件添加到MATLAB路径中，这样MATLAB就可以访问程序，从这里开始称为“函数”

a、 MATLAB路径可以通过在MATLAB命令行中输入“userpath”来确定。

b、 PCCcalc文件的名称不能与函数名（在函数文件的第一行中用“=”号后面的单词表示）不同，否则MATLAB将无法找到并运行该函数。

2. 通过在MATLAB命令行中输入函数名“pearsonCorr=PCCcalc”（不带引号）来运行函数。

3. 将出现一个对话框，允许导航到包含要分析的图像数据的文件夹并对其进行选择。目标文件夹必须包含包含单个荧光通道的图像的.tif（f）文件，名称包含单独的通道名称，例如ch00、ch01、ch02。

4. 出现提示时，在文件名中输入对应于频道标识符的频道名称/“字符串”。

例如，ch00代表蓝色，ch01代表绿色（测试仪），ch02代表红色。

5. 一个RGB图像将出现，显示Hoechst为蓝色，测试仪为绿色，带有十字准线。单击要分析的检测仪波段。

6. 应该出现Hoechst（DNA）染色的BW（黑白）图像。显示的图像来自一个更小的裁剪表单，生成的目的是聚焦于感兴趣的区域，并且只有在这个裁剪的图像中可见的对象才能用于继续进行数据分析。（此“plaquette”的大小硬编码为105 x 105像素，但可以根据个人需要进行调整）。

a、按“t”在该图像和检测仪/绿色通道的BW图像之间切换。

b、在Hoechst染色中寻找与包含检测仪/绿色信号的染色质带相对应的染色质带。

c、准备好后，按“s”键调出赫斯特图像和十字准线。

d、点击目标Hoechst波段边缘的一个点，这将选择一个像素，其强度将用于生成初始Hoechst掩模。

7. 一个窗口，遮罩选择图，将出现四个图像（图4）。上面的图像是BW图像，上面叠加了Hoechst（左）和green tester（右）掩模的轮廓。左下角的图像显示了Hoechst掩模（洋红色）、测试器掩模（绿色）以及两者之间的重叠（白色）。右下角的图像是Hoechst（洋红色）和tester（绿色）通道的图像叠加，重叠的Hoechst和tester掩码用青色勾勒。该青色边界内的区域是用于计算其中的荧光信号之间的相关系数的最终候选区域。加入Hoechst掩模可以确保DNA中没有信号（如果有的话）也不会被纳入计算中。

图4。遮罩选择图。MATLAB数据分析程序“PCCcalc”（）在掩模创建过程中生成的示例图像，用于指定要分析的荧光区域，掩模由感兴趣的带（如LacI融合蛋白）和染色质边界的Hoechst DNA染色确定。补充文件1

8. 可以使用键盘上的以下命令手动调整Hoechst和tester掩码：

按键命令

腐蚀降低电流的Hoechst掩模

通过扩张来增加电流的Hoechst掩模

d使用更高的阈值降低电流Hoechst掩模

f使用较低阈值增加电流Hoechst掩模

u使用上述步骤6d.中选择的候选掩模重新选择Hoechst掩模

z腐蚀降低电流测试仪面罩

x放大电流测试仪面罩

使用更高的电流屏蔽测试仪降低电流阈值

使用低阈值增加电流测试仪掩模

j使用初始候选掩模重新选择测试仪掩模

k重新启动流程并返回到上面的步骤6d

用手画一个与Hoechst感兴趣区域相对应的多边形

我跳过这个图像

r保存掩码并继续计算相关系数

9. 如果Hoechst掩模的操作没有充分限制DNA上存在的感兴趣带的重叠，则按g以手动模式绘制Hoechst掩模。一个新的窗口将打开，显示Hoechst频道的BW图像。

a、使用十字准线在包含感兴趣的测试仪带的DAPI带周围绘制一个多边形，单击DAPI带周围对应于所需多边形点的位置。

b、完成后，单击“返回”第一个点。可以通过使用鼠标拖动来调整各个点，也可以通过在形状内单击并拖动来移动整个多边形。

c、完成后，右键单击多边形内部并从弹出菜单中选择“创建遮罩”。窗口关闭，新的Hoechst掩模出现在掩模选择图中（参见上文第7步）。

d、现在使用以下命令比较并接受或拒绝手绘遮罩：

按键命令

t在新的手绘遮罩和上一个自动计算的遮罩之间切换，如果尝试多次使用，则在先前生成的手绘遮罩之间切换。

p重绘面具。

g接受手绘遮罩，退出手动模式，返回步骤H命令选项。

lR弹出手绘遮罩，使用上一个遮罩并返回到上面的手动调整。

10. 一旦口罩合格，按“r”。

如果无法令人满意地制作出准确表示感兴趣波段的遮罩，则可通过按“i”跳过当前图像。

11. 如果按下了“r”，则遮罩选择图关闭，并打开一个包含五个面板的新图形，即分析结果图（图5）打开。

图5。分析结果图。在完成掩模创建后的MATLAB数据分析中，该窗口显示正在分析的图像、用于分析的掩模以及一次来自两个荧光通道的信号的荧光强度值的图形[红绿（RG）、绿蓝（GB）和红蓝（RB）]，其中每个数据点代表一个像素。从这些关系得到的皮尔逊相关系数（“Corr Coeff”）显示在每个图表的顶部。左上角的免疫荧光染色包括Lac-I（绿色）、Brm（红色）和Hoechst（蓝色）。

a、顶行显示所有三个通道（如第一步中定义的，如红色=目标，绿色=测试仪，蓝色=赫斯特）和最终重叠掩模（右侧）的RGB图像（左侧）。

b、下一行显示三个散点图，每个点代表掩模内的单个像素，其x和y值对应于各自荧光信号的强度。然后计算每对地震道的总PCC（根据每个曲线图中所有点之间的关系计算得出），并显示在每个曲线图上方。

c、裁剪后的图像、结果图和相关系数都自动保存在目录文件夹中生成的名为“autocrop”的子文件夹中。

12. 按任意键继续重复下一个图像/频道集（从步骤5开始）。

13. 重复此操作，直到文件夹中的所有图像都已分析完毕，然后一个名为pearsonCorr的表格将显示在MATLAB工作区中，并将自动保存为“autocrop”子文件夹（标题为皮尔逊公司.mat）的值。

a、按照图像分析的顺序，每列对应一个图像的相关值，每行对应一对不同的通道。

第1行：红绿相关性

第2行：绿蓝相关性

第3行：红蓝相关性

b、然后，应将这些值复制到您首选的绘图/统计分析软件（如Excel、Prism等）中的一个文件中，以便在进行其他数据集或完成分析之前进行后续处理，作为生成的皮尔逊公司.mat具有相关值的文件是MATLAB特有的，在没有MATLAB软件和许可证的计算机上无法访问。

c、我们发现，最好每张幻灯片至少使用10张图片，每个基因型/条件使用3张幻灯片（幼虫）。

d、为了比较条件/基因型之间相关系数的分布，使用以下方法对相关系数r进行Fisher z变换：

z=0.5英寸[（1+r）/（1-r）]

然后可以使用t检验或单因素方差分析比较转换后的相关系数z的分布。如果使用Prism，则使用Tukey的多重比较后验，单向方差分析对这些3+条件/基因型的数据是一种稳健的统计分析。

食谱

1. 冷泉港实验室配方

试剂

1x金额

最终1x浓度

10倍库存金额

最终10倍浓度

氯化钠

8克

137毫米

80克

37.1米

氯化钾

0.2克

2.7毫米

2克

27毫米

Na2HPO4

1.44克

10毫米

14.4克

100毫米

KH2PO4

0.24克

1.8毫米

2.4克

18毫米

注：1倍HCl时pH值为7.4。

2. PBST公司

PBS+0.1%吐温20，从20%的储存溶液中稀释

3. 固定液：2%PFA/45%醋酸

16%PFA在Milli-Q H2O中稀释至2%和100%乙酸稀释至45%

**每解剖30分钟新鲜制备固定液

***16%的PFA在开瓶后4℃保存，3周内使用或染色体结构保存会受损

4. 45%醋酸

用Milli-Q H2O稀释至45%的100%乙酸

**每30分钟解剖一次

5. 阻断液/抗体鸡尾酒碱

PBS+0.1%吐温20+3%BSA（BSA稀释度为每体积的质量，即克每毫升）

致谢

该方案最初发表在库恩等人的研究手稿中。（2019年）。我们感谢Capelson和Little labs的成员在推动该方法发展的研究项目上的投入，并感谢J.Aleman在照片收集方面的帮助。M、 C.得到了美国癌症协会研究学者Grant RSG-15-159-01-CSM和NIH R01GM124143的支持。

相互竞争的利益

作者声明不存在利益冲突。

工具书类

1. Cai，W.，Jin，Y.，Girton，J.，Johansen，J.和Johansen，K.M.（2010年）。用于抗体标记的果蝇多线染色体压片的制备。视觉实验（36）。内政部：10.3791/1748。

2. Kuhn，T.M.，Pascual Garcia，P.，Gozalo，A.，Little，S.C.和Capelson，M.（2019年）。核孔蛋白的染色质靶向诱导染色质去浓缩。细胞生物学杂志218（9）：2945-2961。

3. 帕罗，R.（2008年）。免疫染色法定位多线染色体上的蛋白质分布。2008年CSH协议：pdb.prot4714型.

4. Capelson，M.，Liang，Y.，Schulte，R.，Mair，W.，Wagner，U.和Hetzer，M.W.（2010年）。染色质结合的核孔成分调节高等真核生物的基因表达。140室（3）：372-383。

5. Nakayama，T.，Shimojima，T.和Hirose，S.（2012年）。PBAP重构复合物是染色质边界组蛋白H3.3置换和边界功能所必需的。发展139（24）：4582-4590。