材料和试剂

醋酸纤维素注射器过滤器，孔径0.45微米（赛多利斯Minsart ® ，Sigma-Aldrich公司，目录号：16555-K）
猎鹰® 细胞培养瓶T25，过滤器盖（VWR TM ，目录号：29185298）
玻璃盖玻片22 x 32毫米（Mariendfeld ，目录号：0101112）
载玻片（Sail Brand，目录号：7105）
红细胞（来自临床分离株或寄生虫培养物）
cr啶橙（Thermo Fisher Scientific，目录号：1301）
抗A（ABO1）鼠单克隆抗体用于血液ABO组识别（TransClone ® Bio-Rad公司，目录号：86328）
抗-B（ABO1）鼠单克隆抗体用于血液ABO组识别（TransClone ® Bio-Rad公司，目录号：86470）
带肝素锂的BD Vacutainer TM （Thermo Fisher Scientific，目录号：02-657-28）
Giemsa（默克（Merck），目录号：HX60416604 ）
RPMI 1640介质（HyClone TM ，目录号：SH30255.01）
血清（人，血型匹配或AB组）
Giemsa库存准备（请参阅食谱）
媒体（请参阅食谱）

设备

落射荧光显微镜（Nikon Eclipse，型号：TS100）
光学显微镜（奥林巴斯，型号：BX43）
手计数器

程序

使用富含20％血型匹配血清的RPMI 1640培养基培养恶性疟原虫的寄生虫（对于间日疟原虫，可使用McCoy的5A培养基）。
当大多数寄生虫种群到达晚期时，可以将培养物悬浮液用于实验。
根据实验室技术的可行性，准备一份等分的培养物悬浮液，并用三种方法中的任何一种进行处理（步骤s 4-6）。
在湿法固定准备进行玫瑰花结测定之前，先用Giemsa（按体积计5％工作浓度体积）对悬浮液染色15分钟。
或者，在悬浮液中加入A啶橙（工作浓度2 µg / ml）并染色15分钟，然后湿法制备玫瑰花结。
第三种方法是将悬浮液用于湿装制备而无污染。
通过将上面的少量悬浮液吸到干净的玻璃载玻片上来进行湿式安装，并通过缓慢降落盖玻片将液滴覆盖在干净的玻璃盖玻片上，以最大程度地减少气泡的捕获。
吉姆萨染色和未染色的湿式安装座可以使用光学显微镜（任何型号）查看，而A啶橙染色的湿式安装只能通过荧光显微镜（任何型号）进行查看。
通过募集200个受感染的红细胞来确定花环率。玫瑰花率是受感染的红细胞与未感染的红细胞粘附的百分比。

数据分析

数据分析的详细信息可在研究文章（Lee 等人，2020年）中找到，其中恶性疟原虫的分株率是使用上述三种分株测定方法收集的，各方法之间无显着差异（补充文件7. 玫瑰花结测定法的方法比较。

笔记

需要血清来形成玫瑰花结。
重要的是使所用红细胞的ABO血型与所用血清的类型匹配，以富集培养基。这是为了避免细胞凝集（Sazama，1990；Williamson 等，1999）。如果无法确定ABO血型，请仅使用AB血清。
可以使用实验室适应的寄生虫品系和临床分离株。对于临床分离株，应使用肝素锂真空容器收集血液，并在培养或实验中使用抗凝剂之前，应使用RPMI 1640培养基将细胞清洗至少两次。
尽量避免使用EDTA真空容器收集血样进行玫瑰花结测定。所有抗凝剂都会阻碍玫瑰花结的形成。然而，我们注意到在去除抗凝剂后，EDTA抑制玫瑰花结的作用更加难以恢复，这与早期关于另一种螯合剂EGTA的报道相似（Chotivanich 等，1998）。
寄生虫的分期是通过用光学显微镜读取吉姆萨/菲尔德染色的血液涂片来确定的。晚期/成熟期是寄生虫的血液形式，在寄生虫中积累有可见的疟疾色素（棕褐色黑色色素）。在后期感染的红细胞表面玫瑰配体的表达最佳（Lee 等，2019）。
悬浮液的血细胞比容应在1.5％和4％之间。血细胞比容非常低的悬浮液（图2A）会减慢湿式装载读取过程，并且在这种条件下细胞倾向于移动很多，从而妨碍了平稳的玫瑰花率计数过程。血细胞比容非常高的悬浮液（图2B）将导致“细胞拥挤”，这会阻碍玫瑰花结从单纯的细胞重叠中分化出来。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 2003120--1434 Wenn-Chyau Lee 870597 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.在1％血细胞比容（A）和5％血细胞比容（B）的细胞悬液中发现的玫瑰花结。莲座丛仍然可以可视化。但是，这可能会影响花环表征工作的速度或准确性。比例尺：10 µm。

吉姆萨允许理论值的清晰的可视化市盈率的一个rasites。下湿涂片，ģ iemsa允许normocytes的分化（熟化erythroc ytes）和网织红细胞（年轻/ 未成熟的红细胞），这可能是某些实验的一个重要参数血液学。
未染色的湿样架是进行玫瑰花结检测最简单的方法。但是，将需要调整光强度并使用显微镜的对比度增强功能，以使未染色的寄生虫清晰可见。
在湿法制备之前，请先重悬细胞悬液，以确保细胞悬液正确的血细胞比容。
用于湿安装的细胞悬液的体积取决于所用玻璃盖玻片的尺寸。如果对于盖玻片而言体积太小，则悬浮液将被“涂抹”并“看起来干燥”，这对于花环测定变得不可读。当在显微镜的强光下检查湿式安装座时，会发生蒸发。体积小，蒸发快，在细胞外环境中产生更多的高渗状态，使细胞the裂。
如果体积太小而无法盖玻片，则细胞会迅速“移动”，从而妨碍检查。
对于22 x 32 mm的玻璃盖玻片，7-8 µl的体积是合适的。
切勿长时间阅读潮湿的安装座。在将湿式安装座放置在显微镜载物台上的几分钟后，由于强烈的强光（由于蒸发），细胞开始发生折痕。玻璃盖玻片的边缘/边缘周围的单元格首先受到影响，并且效果会向内传播。一旦细胞被刺穿，湿式支架将不再适合于玫瑰花样测定，应准备新的湿式支架。
湿安装准备中应使用干净的玻璃载玻片（无油/无油脂）。
玫瑰花结现象是在后期发现的现象。如果使用的寄生虫悬液不是阶段同步的，则工人不应将环型阶段包括在其莲座率计数中。

菜谱

Giemsa备料
使用前，用0.45 µm过滤器过滤染料储备液。这是为了确保湿安装中的寄生虫清晰可见。
对于打算用于湿装染色的染料，应每月进行一次染料过滤。
或者，可以使用滤纸进行过滤。但是，请勿过滤大量染料并将其放置太久。
该股票不应暴露在直射的阳光下。
媒体
用20％类型匹配的热灭活人血清丰富普通培养基。例如，将10毫升人血清添加到40毫升普通培养基中，以制备50毫升所需的培养基。使用RPMI1640介质。然而，被用于的McCoy's5A培养基间日疟原虫，可用于形成玫瑰花结的成熟测定法测定对间日疟原虫，以及。

笔记：

实验应使用新鲜培养基。
注意介质的颜色。通常较深的粉红色（碱性）的旧介质可能会影响染料的染色效率。

致谢

LR由A * STAR到SIgN的核心资金支持。LR还由A * STAR赠款（JCO-DP BMSI / 15-800006-SIGN）资助。WCL由新加坡卫生部国家医学研究理事会的开放基金-青年个人研究基金（OF-YIRG NMRC / OFYIRG / 0070/2018）资助。该协议源自已发表的著作：Lee 等。，2020年。

利益争夺

作者没有竞争利益可言。

伦理

疟疾感染的样本是在Shoklo 疟疾研究单位（SMRU）收集的，其批准的道德规范为：OXTREC 04-10（英国牛津大学）；TMEC 09-082（泰国玛希顿大学热带医学系伦理委员会）。

参考资料

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