材料和试剂

60 x 15 mm，经细胞培养处理的Permanox Petri 无菌培养皿（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM ，目录号：150340）
防护移液管（过滤器）的提示（认证的免费用于RNA酶，DNA酶，无菌）（赛默飞世尔科技，Invitrogen公司，目录号：AM126-45（10 亩升），AM126-35（20 亩升），AM126-50（200 亩升），AM126-60（1 ，000 μ升）
2毫升和1.5毫升管仪（Eppendorf，费舍尔小号CI entific，目录号：3810X）
毫升硬组织2个均质管，包含2.8毫米陶瓷（氧化锆）珠CK28（Bertin I 仪器，目录号The：P000911-LYSK0-A，用于Precellys 组织均质器，请参见设备1）
玻璃巴斯德移液器（Mer ck，目录号：CLS7095D5X）
成年C57BL / 6J和B6（Cg）-Spp1t m1Blh / J小鼠（8-12周龄）
磷酸盐缓冲盐水（PBS 生物性能认证，pH 7.4，Sigma-Aldrich，目录号：P5368-10PAK ，在室温下存储）
贝塔- 巯基乙醇（测试版-ME ），分子生物学级（Millipore公司，默克公司，Calbiochem公司，目录号：444203-250ML 或可替代二硫苏糖醇（DTT）可以替代测试版-ME [ 酒店距离Mommaerts 等人，2015年 ] ）
RLT（RNA裂解缓冲液，含有硫氰酸胍）（Qiagen，目录号：79216）
RW1（含有乙醇的RNA 洗涤缓冲液）（Qiagen，目录号：74134）
RPE（RNA洗涤缓冲液）（Qiagen，目录号：74134）
RNeasy R Plus迷你套件（Qiagen，目录号：74134）
或者，可以使用不包含gDNA分离柱的Qiagen RNeasy试剂盒（Qiagen，目录号：75154）
无RNase的DNase集（Qiagen ，目录号：79254）。
缓冲液和分离柱（RNeasy Plus Mini Kit）（Qiagen，货号：74134）
乙醇（CH 3 CH 2 OH）（默克，目录号：02851-1L）
乙醇在H 2 O中的含量为70％（请参阅食谱）
RLT + β -ME或RLT-DTT缓冲区（请参阅食谱）

设备

可调式移液器（Sartorius Biohit Proline Franc e）或微型移液器PIPETMAN L （GILSON，目录号：070053-070058）
试剂容器（Sartorius，目录号：783500 ）。
手术器械（包括一把剪刀，两把细剪刀，两把镊子）（图1i-iv）
小鼠解剖台和解剖玻璃板（图1v）。
Precellys 24系统组织匀浆器（Bertin Technologies，目录号：P000669-PR240-A.0）
Precellys ® 2毫升硬组织homoge nizing陶瓷珠试剂盒（CK28）（Bertin的仪器，目录号：10011151 ，230罗克维尔，MD 20850 USA ）
4°C冰箱和-20°C冷冻机
离心Eppendorf 5415R或5424R（Eppendorf，目录号：5404000410，半径8.3厘米）
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-1000）（Schroeder 等，2006）

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902981--1390 Evie Melanitou 747213 \ Figs jpg \ FIGURE 1.jpg

图1.用于组织解剖和淋巴结隔离的器械i 。剪刀； ii弯曲剪刀； .ii镊子； .iv细剪刀； .. v组织解剖玻璃板。

程序

特殊安全条件应适用当正与利什曼原虫菌属，寄生在实验室，主要的接触途径是通过使用针对感染动物的耳朵里。因此保护应采取措施考虑，即，戴手套，针头预防措施和在P2 plus实验室的通风橱下工作。所有用于解剖组织的器械均应置于70％的酒精容器中，然后在有氯的情况下进行清洗和消毒。

制备
准备2 ml装有陶瓷珠的硬组织均质管，并在标签上标明样品标识。
准备RLT- β- ME 缓冲液（请参见配方）。
用4体积的乙醇（100％）补充RPE洗涤缓冲液。
使用无菌无核酸水制备70％乙醇的稀释液。
标记要用于从片段化组织中进行RNA分离的下一步的试管。
准备细胞培养皿，并加入3 ml PBS。
解剖组织
选择用于实验的不同年龄的成年C57BL / 6J和B6（Cg）-Spp1t m1Blh / J小鼠用CO 2 麻醉。
用乙醇洗涤后再用PBS洗涤后，将要分离出组织的区域，切下被寄生虫的耳朵（左耳）并丢弃感染区域周围的组织，并从右耳分离出一个相似的区域（非被感染）用于控制（图2）。

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2.网站图接种中利什曼原虫亚马孙寄生虫耳朵的真皮C57BL / 6J小鼠。作者A. 耳病变显示在感染（INF）耳廓，（我和㈡）控制非感染耳廓，（㈢ ..）圆圈显示了分离的总RNA制备B - C 的耳朵区域。.苏木精和曙红（H Ando E）从C57BL / 6J小鼠耳耳鼻咽喉处的组织切片染色B. 感染了利什曼原虫Amazonensis （INF）：A：表皮与棘皮病； B：发炎的真皮； C：软骨C.未感染（非INF）的耳朵：A：表皮； B：真皮； C：软骨D.表达利什曼原虫亚马逊菌丝体的萤光素酶的生物发光成像感染了小鼠的耳真皮。彩色条指示萤光素酶发射的密度，描绘了耳廓感染区域存在的寄生虫数量。

用PBS快速洗涤每个组织片段，并将其放入单独的均质管中。
剃毛后，在每只耳朵侧面的区域切开皮肤，并从两侧隔离掉引流淋巴结的部位（左侧感染，右侧用作对照）。从周围组织中清除淋巴结使用玻璃解剖皿（图1vi）。
将淋巴结放在新的均质管中。
组织的解剖过程在图3中描述。
D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902981--1390 Evie Melanitou 747213 \ Figs jpg \ 3.jpg

3. 从小鼠中分离组织的逐步步骤图。牺牲小鼠耳廓上的利什曼原虫亚马逊寄生虫多次感染后，对小鼠进行牺牲（1）。切除耳组织的感染区域，并进行短暂清洗在培养皿中用PBS将耳朵片段放入装有小珠和RLT缓冲液（2）的Precellys 24管中，将耳廓引流的耳淋巴结通过外科手术切除，然后放入装有小珠和小管的新试管中。 RLT缓冲液（3）。淋巴结密集并沉入试管液中，在Precellys 24匀浆器（4）中将组织匀浆，然后将匀浆放入两个新的Eppendorf 2 ml管中以制备总RNA（5）。。涉及动物的所有程序均已严格按照欧洲准则由动物福利制度委员会批准。

从组织中提取RNA
注意：我们对总RNA制备过程的描述遵循Qiagen提供的RNeasy Plus Mini Kit进行RNA分离的协议，并做了一些小改动，我们的起始材料始终是每次制备一个耳朵片段或一个淋巴结，这些组织大约产生10-50 Myu G 的总RNA，取决于组织。1 Myu G 的总RNA产生1 Myu G 的CDNA。从这些CDNA制备物中，每个实时PCR反应使用10 Ng。

那准备将包含组织中加入1毫升的RLT Tasu管贝塔-ME缓冲区因为耳朵片段和400 MYU 大号中钍é相同缓冲淋巴结。
将组织放入试管中，然后在Precellys 24仪器中进行组织破碎。按照制造商的说明，将组织以600 x g 匀化60 s （https://www.youtube.com/watch?v= uMT60IHYDuQ）。
从Precellys 24中取出试管，并在室温下以15,000 xg （13,000 rpm）离心2分钟。
地点250 MYU 大号从耳匀浆和整个淋巴结匀浆（400 MYU 大号）在单独的每种组织DNA保留列（gDNA中消除离心柱，Qiagen）中。离心9 ，000 ×g下（10,000rpm）下90 S.
保留流出物并丢弃DNA分离管。
175将70 Pasento的Myu L 乙醇加入到含耳均质物的试管中，并将280 Myu L 的含有淋巴结的试管中，使用P1000 移液器对样品进行均化。
将样品转移到RNA保留柱（RNeasy旋转柱，Qiagen）上，并以9000 xg （10,000 rpm）离心90 s。
含管消除污水和地点列在新的收集管（1.5毫升）。如果DNA酶处理不用于继续在小号Tep的Ç 10。
如果进行了DNase消化（使用Qiagen试剂盒进行RNA制备），则将样品（S Tep C 4 ）直接放在RNA保留柱上，然后进行另外的S Teps D1至4 。
在柱上添加700 MYU 大号中RW1 RNA结合缓冲液（Qiagen公司），离心在9 ，000 XG （10,000 RPM）为60 S.消除污水，但使用的下一步同样的集热管。
在该色谱柱上，添加500 Myu L 的RPE Tasu乙醇缓冲液（确保其处于室温）。
离心SA mples 9 ，000 ×g离心60秒（10000转），消除的流出物并重新使用收集管。
再次重复步骤C10和C11，并取消收集管。
放置柱到一个新的收集管和离心9 ，000 ×g下（10,000rpm）下2分钟后，完全干出的列。
离心步骤重复更加在15 ，000 ×g下（13,000转）2分钟。
将收集管替换为1.5 Ml Eppendorf新管，并通过向每个样品的柱中心添加30 Myu L 的RNase /无DNase无菌水进行RNA洗脱步骤。
在15离心力下，000 Xg （10,000 Rpm）持续60 S.
1.5稀MYU 大号每个RNA样品中的20的MYU 大号无菌水在新管。
1 MYU 大号各稀释样品用于RNA量化和质量评价，通过测量的光密度（OD）在甲纳米滴ND.-1000微分光光度计（Thermo Fisher Scientific公司）（图4）。
使用前，将所有RNA保持在-80°C。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1902981--1390 Evie Melanitou 747213 \ Figs jpg \ 4.jpg

4.总RNA图浓度和质量评估。用NanoDrop N D -1000显微分光光度计测量的RNA的光密度（OD）的代表性图像。未降解的RNA制备（样品1，上图）和质量较差（降解的）RNA制备样品（样品2，下图）显示了核酸（蓝色实线）的波长（260 nm）和蛋白质（蓝色虚线）的280 nm的波长（λ ）。吸光度比260/280 （〜 2.0）和二百三十○分之二百六十零（≥ 2.0）表示RNA（前的纯度。分别不存在有机化合物和蛋白污染物的）.RNAs浓度以ng /给定μ 升，同时在考虑1个OD阿260 单元的单链RNA = 40 Myu G / Ml。低A 260/280 浓度（下图）表示在制备过程中残留的试剂污染，并且在260处没有明显的吸光度表示RNA质量差（请参见注释2）。

样品的DNase处理（Qiagen试剂盒，目录号79254）
对添加的RNeasy离心柱350 MYU 大号缓冲RW1，盖上盖子，轻轻地，离心机在8 ，000 XG ，15秒洗旋转柱的膜上。丢弃的流量通过。
70在管中准备Myu L 缓冲液RDD（不含RNase的DNase组），并添加10 Myu L DNase I储备溶液，由于DNase对物理变性敏感，因此应轻轻混合，请勿涡旋。
80在MYU 大号的DNA酶I温育混合物直接进入膜的RNeasy旋转柱和留在台式15分钟（20-30 ℃）。
350添加MYU 大号缓冲液RW1到RNeasy旋转柱，盖上盖子轻轻Centrifu 葛在8 ，000 ×g下对于15 S.丢弃的流量，并继续与所述第一RPE缓冲液洗涤（步骤Ç 11）。
数据一nalysis

根据我们的协议中，我们已经分离出的RNA从感染的动物和非感染利什曼原虫亚马孙parasites.Our米ethod允许在制备好量，未降解的总RNA的足以用于几种基因的RT-PCR实验（吉罗等人。， 2019b）。

从这些制备物中获得的数据在原始发表的文章（Giraud 等，2019b ）中的图6d和图S8中进行了描述。

如上文在C节（从组织中分离RNA）所述，我们已经考虑到1 Myu G 的RNA产生1 Myu G 的CDNA。对于CDNA的制备，我们使用了随机六聚体（Roche Diagnostics）和MMLTV-RT逆转录酶（ Invitrogen公司，Life Technologies）中每RT-PCR反应（与使用0.10纳克的cDNA 的QuantiTect 如原始制品的方法部分所述的SYBR Green试剂盒，Qiagen）（吉罗等人。，2019 b ）.RAW岔点（将cp ）值用作qBase 软件程序（https://www.qbaseplus.com/）的输入。通过使用管家基因的qPCR定量值进行适当的归一化来校正相对定量值的计算。对于每个实验组织，qBase 软件可以对数尺度计算归一化和重新定标的数量。这是由qBase 程序的集成算法提供的自动化过程，如Hellemans 等人（2007年）所述。

在我们的实验图上描述的URE 6和图URE 手稿的S8（吉罗等人。，2019b ），所述的相对表达（量）OPN 基因和编码对炎性multicomplex的基因分别计算由对数变换比率骨桥蛋白突变小鼠（C57BL / 6 -/- ）与野生型骨桥蛋白阳性（C57BL / 6 + / + ）小鼠中利什曼原虫感染组织表达倍数差异的比较。

笔记

公式如下：
g力（RCF）=（rpm）2 x 1.118 x 10 -5 xr 用于将rpm（每分钟转数）转换为g力或相对离心力（RCF）.RCF或g是施加到样品的加速度离心过程中（请参阅：https：//www.promegaconnections.com/converting-rpm-to-g-force-rcf-and-vice-versa-2/）。

该转换取决于转子的半径r。

RNA浓度和质量对于使用此核酸的最佳反应性能至关重要.RNA的平均浓度及其纯度通过分光光度法定量测量.NanoDrop 分光光度计中包括一个用于RNA浓度测量的预设程序，该程序可以自动读取OD分别在230、260和280 Nm处进行计算（图4），此外仅需要1至2 Myu L 的样品，将空白溶液与相同的溶液一起使用，在该溶液中将RNA稀释后再进行RNA测量。的分光光度计。RNA具有最大吸光度（光学密度）在260nm处，吸光度单位用作转换因子对于RNA浓度在260 的ssRNA = 40 MYU ģ /毫升。为了评估RNA纯度OD 260 和OD 230个测量结果还寿LD在consideration.A采取260/280 〜2的比率被接受为纯RNA.Low 260/280比率通常表明蛋白质的存在contaminants.A高接在A处230 ABSO rbance表示存在蛋白质以外的污染物，例如残留的苯酚，胍或其他试剂。纯RNA的260/230 比值通常高于各自的260/280 值。通常260/230的比值在2.0-2.2。低于1.5的比率表示存在污染物。可以通过在1％琼脂糖凝胶上运行RNA来检查RNA完整性并评估核糖体RNA条带的完整性。真核细胞中的28S条带（rRNA上部带）应是rRNA下部条带（18 S ）的强度的两倍，两个条带应清晰而紧密，否则涂片的存在表明RNA降解高分子量的存在条带显示了被DNA污染。另一种检查RNA完整性的可能方法是使用Agilent Bioanalyzer （https://www.agilent.com/cs/library/applications/5989-1165EN.pdf）。 rRNA条带决定b •比较RNA完整性编号（RIN）。

菜谱

乙醇70％
在200毫升玻璃瓶中的70毫升乙醇（CH 3 CH 2 OH）（Merck ）中加入30毫升无菌（无RNase / DNase的）水。

RLT + β- ME缓冲液
注意：RNeasy试剂裂解缓冲液（Qiagen公司RLT或用Qiagen的RNeasy试剂盒提供）中含有异硫氰酸胍（GITC）。为了减少RNA酶的活性，β - 巯基乙醇（β -ME 使用之前）加入到RLT缓冲液。

每1毫升RLT缓冲液可添加20 毫克的β- MEMyu L. 此含β- ME的RLT缓冲液可稳定长达一个月
警告：β- ME是有毒化学物质，应分配在通风橱中，并穿适当的防护服。

可替代地，β -ME可以通过20取代μ 升的Dithiothreito 升2M（DTT）每毫升RLT缓冲液的
RLT可补缓冲器与β -ME或DTT，如所描述的，在均化管将包含耳廓（1毫升/管）和淋巴结（400加入μ 升/管）（酒店距离Mommaerts 等人，2015）。

致谢

这项工作得到了巴斯德研究所的机构资助。我们感谢免疫生理学和寄生物学小组的成员对这些实验程序的建议，以及他们参与本协议所衍生的已发表论文中描述的原始工作的感谢。（Giraud 等人，2019b ）。

利益争夺

作者宣称，没有与这项工作相关的金融或非金融竞争利益。

伦理

我们实验中使用的所有动物均在巴斯德研究所的动物设施中以SPF条件饲养，并在12/12小时的暗光周期下饲养，可随意获取食物和水。所有实验方案均已得到机构委员会的批准严格按照有关动物护理的欧洲准则（指令2010/63 / EU）对动物福利进行评估。

参考文献

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