材料和试剂

1. 5毫升注射器e （BD，货号：309646）

2. 18克x 1 ½针（BD，目录号：305196）

3. 15毫升conicals （VWR，目录号：525-1069）

4. 50毫升conicals （VWR，目录号：505-1074）

5. 70 μ米细胞过滤（FISHERBRAND ，目录号：22363548）

6. 96孔板，U型底（Falcon，目录号：353077）

7. 1毫升Luer -Lok Tip注射器（BD，货号：309628）

8. 20规格x 1英寸Introcan Safety IV导管（Braun，目录号：4252543-02）

9. 计数珠：Polybead 聚苯乙烯15.0 μ 米微球（Polysciences公司，目录号：18328）

10. GentleMACS M试管（Miltenyi Biotec ，目录号：130-093-236）

11. Middlebrook和Cohn 7H10琼脂平板（Fisher Scientific，目录号：B21174X）

12. 网状尼龙23 x 23厘米（VWR，目录号：47746-106）

13. 5毫升聚苯乙烯圆底管，“ FACS管”（Corning，目录号：352054）

14. 5毫升带过滤器盖的聚苯乙烯圆底管（Corning，目录号：253235）

15. GentleMACS C试管（Miltenyi Biotec ，目录号：130-093-237）

16. 小鼠：C57BL / 6（杰克逊实验室，目录号：000664）

17. 荧光Mtb菌株：mEmerald-H37Rv（非商业销售，H37Rv背景菌株可从BEI获得，目录号：NR-123 ，有关更多信息，请参见下面的过程注释）

18. 潮霉素B （VWR，目录号：80501-072）

19. Liberase Blendzyme 3（Sigma - Aldrich，目录号：5401020001）

20. DNase I（西格玛- 奥尔德里奇，目录号：10104159001）

21. RPMI（Gibco，目录号：11875-093）

22. FBS （峰值血清，目录号：PS-FB1）

23. 70％乙醇（Fisher Sci entific ，目录号：04-255-92）

24. 抢占RTU消毒液（ Contec ，目录号：21105）

25. 不含钙和镁的PBS （Corning，目录号：21-040-CV）

26. ACK裂解缓冲液（Gibco，目录编号：A10492-01）

27. FcBlock ，抗CD16 / 32（克隆2.4G2）（BD Pharmingen，目录编号：553141）

28. 僵尸紫罗兰色可固定可行性套件（Biolegend ，目录号：423113）

29. 流式细胞术抗体（在也列P rocedure部）

甲NTI小鼠的Siglec F（克隆E50-2440，BD Pharmingen公司，PE，目录号：552126）
甲NTI小鼠CD45.2（克隆104，Biolegend公司，PerCp-Cy5.5的，目录号：109828）
甲NTI小鼠CD64（克隆X54-5 / 7.1，Biolegend公司，APC，目录号：139306）
甲NTI小鼠CD3（克隆17A2，eBioscience公司，APC-eFluor780，目录号：47-0032-82）
甲NTI小鼠CD19（克隆1D3，eBioscience公司，APC-eFluor780，目录号：47-0193-82）
甲NTI-小鼠/人CD11b的（克隆M1 / 70，Biolegend公司，亮紫570，目录号：101233）
甲NTI小鼠IA / IE（MHC II）（克隆M5 / 114.15.2，Biolegend公司，APC，目录号：107614）
甲NTI小鼠的CD11c（N418克隆，Biolegend公司，亮紫605，目录号：117333）
甲NTI小鼠Ly6G（克隆1A8，Biolegend公司，亮紫711，目录号：127643）
30. 20％低聚甲醛（电子显微镜科学，目录号：15713-S）

31. Trizol （Invitrog zh，目录号：15596018）

32. Tween-80（Sigma-Aldrich，目录号：P1754）

33. HEPES（Sigma-Aldrich ，目录号：H4034）

34. MgCl 2 （Sigma-Aldrich ，目录号：M2393）

35. 氯化钾（Sigma-Aldrich ，目录号：P3911）

36. 氯化钠（Sigma-Aldrich ，目录号：S5886）

37. CaCl 2 · 2H 2 O（Sigma-Aldrich ，目录号：C3306）

38. NaOH（10 M）（Sigma-Aldrich ，目录号：72068）

39. NaN 3 （西格玛奥德里奇，目录号：S2002）

40. 感染缓冲液（请参阅食谱）

41. HEPES缓冲区（请参阅食谱）

42. 肺消化缓冲液（请参阅食谱）

43. CFU稀释缓冲液（请参见配方）

44. FACS缓冲区（请参阅食谱）

设备

P ipettes
离心机：CAPAC 两者均15个50毫升conicals 和96孔板
全尺寸吸入暴露系统（带有7-1 / 2” x 6”不锈钢5篮系统的099C A4212型）（Glas -Col，目录号：099C 0616700025）
解剖剪刀和镊子
Vannas 微型剪刀（VWR，目录号：82030-284）
温柔MACS 组织分离器（Miltenyi Biotec ）
BD LSR II（BD Bioscience），使用BD FACSDiva 软件
4激光设置：紫色（405 nm），蓝色（488 nm），绿色（532 nm）和红色（640 nm）

BD Aria （BD Bioscience），使用BD FACSDiva 软件
4激光设置：紫色（405 nm），蓝色（488 nm），绿色（532 nm）和红色（640 nm）

37°C保温箱
-80 °C冷冻室

软件

BD FACS Diva （BD，https://www.bdbiosciences.com/zh-cn）
FlowJo（Tree Star Inc.，https: //www.flowjo.com/ ）

程序

注意：小鼠的购买，维护和实验需要得到机构动物护理和使用委员会的事先批准。在这种情况下，方案由西雅图儿童研究所的机构动物护理和使用委员会批准。

结核分枝杆菌（Mtb）的制备
ñ OTE 小号：

Mtb的所有工作应根据需要在生物安全柜内的BSL-3 / ABSL-3套件中进行，并由设施经理和EHS部门指定适当的PPE。
此处使用的mEmerald-H37Rv菌株不可商购（由UMass医学院的Chris Sassetti 提供）。提供H37Rv背景菌株（BEI，目录号：NR-123）和荧光报告菌株可以通过电穿孔通过细菌转化而产生。分枝杆菌H37Rv的荧光应变的产生超出了本协议的范围，但类似的REAG 已废除被通过审查MacGilvary 等。（2018），并在Goude 等人的协议中详细描述。（2015）。
为了达到约2,000-4,000个细菌的初始剂量，请解冻10 x 1 ml带有荧光标记的Mtb（mEmerald-H 37Rv）的小瓶。细菌最初生长在7H9补充有50 μ 克/ ml的潮霉素B，在OD = 1.0对数生长期冷冻向下（无甘油补充），并储存在-80 ℃下。
将15 ml锥形杯中的10 ml Mtb合并，并在离心机中以1,850 xg的转速离心10分钟。弃去上清液，将细菌沉淀物最初用1 ml感染缓冲液（配方1）重悬，并用p1000移液器吸头以使任何团块破碎。然后，添加另外的4 ml感染缓冲液和涡旋样品（至少10 s ），直到没有可见的团块为止。

Glas- Col吸入暴露系统中的Mtb气溶胶感染
注意：对于使用的分枝杆菌气雾剂感染的详细协议GLAS -COL系统，请参阅以下协议：（奥德韦等人的“分枝杆菌感染的动物模型” 。，2011）。

将小鼠装入Glas -Col不锈钢篮的隔间中。至少包括3只其他相同年龄和品系的小鼠，以测量初始感染剂量（沉积）。
注：参见小号挠度I：“ 通过集落形成单位测定中的细菌负荷沉积” 上确定传染性细节剂量。

将雾化器放在Glas -Col机器的出口上，检查是否正确对准。
用三个金属夹固定雾化器，并拧紧每个夹上的螺母以确保密封。将特氟隆隔垫放入螺帽中，并牢固地拧入雾化器，确保不要过度拧紧。
用连接在5 ml注射器上的18 G针吸取5 ml Mtb培养物。将注射器移至雾化器，然后将针头插入隔垫。缓慢推动柱塞并将Mtb注入雾化器储液罐的底部。小心取出注射器，并将其放入生物安全柜内的利器容器中。
关闭气雾室的盖子，用力按四个闩锁中的每个闩锁，直到听到喀哒声。
打开主电源开关并按以下步骤设置雾化程序：
预热15分钟。
40分钟雾化。
40分钟云衰变。
15分钟净化周期。
按F1开始运行。
雾化循环完成后，确认雾化器中剩余的液体少于1 ml。卸下雾化器，然后立即将雾化器，螺旋顶部和夹具放入100％的PREempt 浴中，进行30分钟的去污。净化后，用自来水冲洗所有部件3次，并用70％乙醇彻底喷洒以进行清洁。干燥后固定在储物盒中。
打开盖子，从室内取出老鼠。
拆卸篮子，并用PREempt消毒，然后用70％乙醇对所有可移动部件，腔室和盖子进行消毒。重新组装篮子。

肺组织的收获和加工
感染后12 h至14天的任何地方均可收集肺组织进行分析。
通过暴露CO 2 或颈脱位使小鼠安乐死。因为已知暴露于CO 2 会扰乱Mtb和免疫细胞功能（Ellner 等，1967； Howard 等，1990），所以宫颈脱位优选用于转录分析或表征免疫细胞功能的实验。解剖是安乐死所需的第二物理方法。
将鼠标置于仰卧位置，并用70％的乙醇蘸湿毛皮。刚好在肋骨笼下面切开切口。进行中线切口，使皮肤退缩到头部上方和大腿下方。在腹膜壁的中央切开一个切口，露出隔膜。
通过切开隔膜并向上打开肋骨腔的侧面来打开肺腔，而不会打扰肺组织。
将所有肺组织收集在温和的MACS C管中，其中包含5 ml新鲜制备的肺消化缓冲液（配方3）。
将试管连接至gentleMACS 分离器并运行程序“ m_lung_1”。
将试管在37 °C下孵育30分钟以进行游离酶消化。
将试管重新连接至gentleMACS分离器并运行程序“ m_lung_2”。
通过70通过消化的肺μ 米细胞过滤到50ml圆锥形。使用3 ml注射器柱塞将所有剩余的组织推过过滤器。用RPMI冲洗C型管并通过过滤器。用额外的RPMI冲洗滤网，将大约40 ml的培养基添加到原始消化缓冲液中。
在4 °C下以500 xg 离心消化的肺样品10分钟。丢弃上清液并重悬细胞沉淀。
（可选）添加1 ml ACK裂解缓冲液，并在室温下孵育2分钟。加入含10％FBS的RPMI终止裂解，并在4 °C下以500 xg离心10分钟。丢弃上清液。
注意：从样品中去除红细胞可以减少流式细胞仪上样品收集的总时间，并增加目标细胞群的百分比。但是，如果不小心进行裂解，则会影响细胞的整体生存能力。

重悬沉淀在1ml的FACS缓冲液的RPMI或RPMI并穿过第二70 μ 米细胞滤网。将细胞转移到96孔U底平板上进行流式细胞术抗体染色。

支气管肺泡灌洗（BAL）细胞收获
注意：要分离受Mtb感染的肺泡巨噬细胞，预先富集气道可及细胞，并避免在步骤中进行酶消化，请进行支气管肺泡灌洗（BAL），而不是收获整个肺组织。

感染后12小时到14天之间，可以收集BAL进行分析。
安乐死小鼠通过颈脱位。
将鼠标仰卧在聚苯乙烯泡沫塑料板顶部（一次性使用）上，并用70％乙醇润湿毛皮。固定四肢固定鼠标。为了进入气管，放置鼠标以使头部伸出聚苯乙烯泡沫塑料垫正好会有所帮助（图1A）。
在肋骨笼的正下方做一个切口。小心地从腹部到嘴巴在皮肤上做中线切口。用镊子撕开皮肤，露出胸部和腹膜区域。在腹膜壁的中央切开一个切口，露出隔膜（图1B-1C）。
切开隔膜并向上穿过肋骨腔，露出胸腔，而不会打扰肺组织。暴露肺组织可以观察呼吸道在灌洗过程中的扩张情况，并减轻肺叶的压力，从而使肺组织在每次灌洗过程中更自由地扩张。
切下颌下唾液腺的中心。注意不要在两侧平行切开颈动脉。然后，小心地切开胸甲肌肉以暴露气管（图1D）。
使用微剪刀在气管中央做一个小切口，在其上开一个恰好足以穿入导管的孔（图1E）。
将装满冷PBS的1 ml注射器连接到导管上，然后将其插入气管，直到足够牢固地固定住它。缓慢注入1 ml PBS，同时观察肺膨胀，然后缓慢均匀地将注射器拔出（图1F-1H）。如果在充满1毫升之前感觉到阻力，请勿继续注入体积。通常，第一次清洗只能注射0.7-0.8 ml（特别是对于年幼或较小的小鼠）。总共重复进行3次注液和撤回操作，而无需卸下导管。然后，在第三次缩回时，将液体收集在15 ml的锥形杯中（通常不会回收全部1 ml）。
注意：作为参考，类似的灌洗程序视频的例子可以在发现范Hoeck ë 等。（2017）和Gereke 等人。（2012）。请注意，在这些规程中，导管是通过缝合线与气管绑在一起的，而我们发现，在不打结的情况下插入和拔出导管（图s 1F-H），可以重复清洗，效率更高，并且可以实现等效隔离细胞。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-20 \ 3630--1902941--1412 Alan Diercks 813998 \ Figs jpg \ Figure1_updated.jpg

图1.使用20号x 1英寸Introcan Safety IV导管收集支气管肺泡灌洗液。A.将针固定在聚苯乙烯泡沫塑料上的仰卧位置。B.切开皮肤以露出胸部和腹膜区域。C.切开腹膜壁，然后切开隔膜，露出肺腔。D.切开颌下唾液腺和胸甲甲状腺肌肉以暴露气管（为了清晰起见，取下了肋骨笼）。E.使用小剪刀s 在气管中央切一个小切口（白色箭头）。F.将导管插入气管。GH。观察到在注射1 ml PBS后肺膨胀。

再重复1 ml洗涤3次，总共回收到约4 ml BAL液。将样品存放在冰上。
一只小鼠产生s〜0.5 x 10 5 -1 x 10 5 肺泡巨噬细胞。此时可以合并来自多只小鼠的BAL样品。
通过7通BAL流体0 μ 米细胞滤网。尽管样本看起来非常稀薄，但这仍然是至关重要的一步，因为灌洗过程会收集可能阻塞流式细胞仪或细胞分选仪的组织碎片。
在离心机样品1 5毫升锥形，在500 ×g下在10分钟4 ℃。在200丢弃上清，重悬细胞沉淀μ 升RPMI或FACS缓冲液。将细胞转移到96孔U底平板上进行流式细胞术抗体染色。

细胞悬液的流式细胞仪抗体染色
为了获得最佳的抗体染色效果，每只孔中要从幼稚小鼠或感染时间少于1 0天的小鼠中吸取1/4或更少的肺样品。对于感染超过10天的小鼠，每孔甚至应使用更少的肺样本，以免超过每孔1 x 10 6 -2 x 10 6个细胞。对于BAL样品的染色，每孔合并不超过5-7只小鼠。
将U型底板在4 °C 下以500 xg离心4分钟。
在50重悬样品μ 升FACS缓冲液与FcBlock 以1：100稀释。在4 °C下孵育10分钟。加入150μlPBS 洗涤并在4 °C下以500 xg离心4分钟。
在50重悬样品μ 升PBS以1：200僵尸紫罗兰活力染料。在4 °C下于黑暗中孵育10分钟。添加150 μ 升FACS缓冲液洗在离心板500 ×g下4分钟，在4 ℃。
在50重悬样品μ 升FACS缓冲液与抗体染色鸡尾酒。见下文。
注意：使用来自消化过的幼稚肺的细胞进行单色控制以进行补偿。包括一个幼稚的肺部样品以设置所有细菌的荧光门，并包括所有带有*标记的抗体的荧光减一（FMO）对照，对于这些抗体，流动门控的正确位置并不总是很明显。

用于肺泡巨噬细胞细胞分选的抗体染色混合物：
注：所有抗体是来自生物升egend 除非其他明智的注意。抗体通常以1：100使用，但可能需要滴定。

Siglec F（克隆E50-2440）– PE（BD Pharmingen）
CD45（克隆104）– PerCp-Cy5.5
CD64 *（克隆X54-5 / 7.1）– APC
转储通道：CD3（克隆17A2），CD19（克隆1D3）- APC- eFluor 780（eBioscience公司）
CD11b（克隆M1 / 70）– 艳紫570
保持FITC通道打开以供EmEald使用，辉煌紫罗兰421打开以供Zombie Violet活力染料使用
用于肺髓样人群流式细胞仪分析的抗体染色混合物：
注：所有抗体是来自生物升egend 除非另有说明。

Siglec F（克隆E50-2440）– PE（BD 帕明根）
CD45（克隆104）– PerCp-Cy5.5
CD64 *（克隆X54-5 / 7.1）– PE-Cy7
IA / IE（MHC II）*（克隆M5 / 114.15.2）– APC
转储通道：CD3（克隆17A2），CD19（克隆1D3）- APC- eFluor 780（eBioscience公司）
CD11b（克隆M1 / 70）– 艳紫570
CD11c *（克隆N418）– 艳紫605
Ly6G（克隆1A8）– 艳紫711
保持FITC通道打开以供EmEald使用，辉煌紫罗兰421打开以供Zombie Violet活力染料使用
在4 °C下于黑暗中孵育20分钟。添加150 μ 升FACS缓冲液洗在离心板500 ×g下4分钟，在4 ℃。
抗体染色后：
在100，用于流式细胞分析产生的样品，重悬样品μ 升2％多聚甲醛。在室温下孵育1小时，然后将样品转移到新板中，然后再从ABSL-3套件中取出。
用于细胞生成的样本排序，在150个悬样品μ 升FACS缓冲液中并转移至FACS管。转移到细胞分选仪时，将管放在冰上。

计数珠测定
为了制备用于细胞数量的分析样品，结合10 μ 升与100样本μ 升稀释计数珠（稀释至〜1.0× 10 5 / ml的计数使用血球计的最终浓度）和100 μ 升在96孔4％多聚甲醛U底。
在室温下孵育1小时，然后将样品转移到新板中，然后再从ABSL-3套件中取出。

肺或BAL样品的细胞分选
立即排序之前，过滤器样品通过量H 35 μ 米目尼龙到新的FACS管。另外，可以使用带有内置过滤器的FACS管过滤样品，但是根据我们的经验，对于细胞数较少的样品，使用这些样品会导致更多的样品损失。
运行单色控件以设置电压和补偿矩阵。
由于BAL样品非常珍贵，只有很少的电池，因此在对照样品上建立电压，补偿和选通至关重要。在运行样本进行分选之前，将原始样本和经Mtb感染的消化肺样本作为对照是很有用的。肺泡巨噬细胞往往比许多其他髓样细胞类型更大且具有更多的自发荧光，因此，使样本包含肺泡巨噬细胞来设置适当的门和电压会很有帮助。
如图2所示设置门。
D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902941--1412艾伦·迪尔克斯813998 \ Figs jpg \ Figure2 .jpg

图2.流式细胞仪选通策略，用于从支气管肺泡灌洗液样本中分选出肺泡巨噬细胞。使用以下染色剂和抗体鉴定并分类天真的，旁观者和受Mtb感染的AM人群：僵尸紫，CD45，CD3 / CD19，CD11b，Siglec F和CD64。

用10％F BS 在RPMI中收集分类细胞。我们发现与5 ml FAC S管式收集管相比，15 ml 锥形管的产量增加。进行RNA分离时，我们会收集尽可能多的细胞。合并10-12只小鼠的BAL通常会产生约1 x 10 3 -2 x 10 3 Mtb感染的AM和1 x 10 5 -2 x 10 5 旁观者AM。
在4 °C 下以500 xg的转速离心分选的样品10分钟。
丢弃上清液并将样品重悬于1 ml TRIzol中。在分离RNA之前，将样品在-80 °C 冷冻过夜。

肺样品的流式细胞仪分析
运行并收集单色控制样本以设置补偿矩阵。
为了捕获足够的受Mtb感染的细胞以进行分析，请收集尽可能多的事件，最少要200,000个事件，但理想情况下要> 1,000,000个事件。
收集至少10,000-20,000个事件以计数珠子样本。
注：˚F orward散射和侧向散射电压将需要从那些集调整为细胞样本采集，以适应显示了较高的正向和侧向散射值的珠子，以确保它们的地块中可见。

通过菌落形成单位测定法进行细菌负荷沉积
注意：由于感染剂量相对较低，因此重要的是使用整个肺（所有肺叶）而不是单个肺叶来估计细菌沉积。

用2 ml CFU稀释缓冲液制备GentleMACS M管。
安乐死小鼠，分离肺（如上所述），并将肺放入M管中。
将试管连接至gentleMACS 分离器并运行程序“ Protein_01”。
从每个样品中，将200ul以下稀释液平板接种到7H10平板上：
干净的样本（总肺的1:10）
1:10稀释（全肺1：100）
1：100稀释度（1：1 ，总肺的000）
让板干燥5-10分钟。将板倒置在37 °C 恒温箱中21天，以允许菌落生长，然后进行计数。

数据分析

流式细胞仪分析
使用单色控件补偿FlowJoe中的样本，以生成补偿矩阵。
按照图3中的肺髓样门控方案分析FlowJo中的数据（改编自Misharin 等人，2013和Kopf 等人，2015）。事件最初由FSC-A和SSC-A控制，以排除由细胞碎片组成的低FSC / SSC事件。然后将细胞选通在FSC-A和FSC-H上以排除双峰。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-5-20 \ 3630--1902941--1412 Alan Diercks 813998 \ Figs jpg \ Figure3_updated.jpg

图3. 流式细胞术门控策略，用于鉴定感染了Mtb的骨髓细胞群。A. Mtb感染的肺的初始门控。B. （蓝色轮廓）双峰排除后所有细胞的细胞群门控策略。（绿色轮廓）mEmerald + Mtb 感染细胞的细胞群门控。C. ˚F luorescence负一（FMO）和用于关键门天然对照。

计数珠分析
使用图4中的门控方案在FlowJo中设置珠门控。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902941--1412艾伦·迪尔克斯813998 \ Figs jpg \ Figure4 .jpg

图4.流式细胞仪选通用于计数珠分析

计算单元格编号如下：
计算每个样品添加的珠子总数：
例如：1.1×10 5 /毫升×100 μ 升= 1.1×10个4 珠

计算与总肺部相比测得的样品的乘数：
例如：10 μ 升将1ml所使用的总样品= 100乘法因子

计算的珠子％和％的细胞中的FlowJo 门。
例如：10％的磁珠和90％的细胞事件

计算肺中的总事件。
注意：此数目将大于细胞总数，因为它将包括流式细胞仪识别并计数为事件的细胞碎片。

（％细胞/％珠子）x（珠子数）x（样品的乘数）

（90/10）x（1.1 x 10 4 ）x（100）= 9.9 x 10 6 肺总事件

计算肺中选择的细胞总数：
（事件总数，请参阅2d）x（细胞总数的总分数）=（肺中的总数＃）
例如，肺泡巨噬细胞占肺总事件的2.0％：（9.9 x 10 6 ）x（0 .02）= 1.98 x 10 5 肺泡总数

笔记

如果将细胞用于转录分析或离体功能测定，则在尽可能多的操作流程（包括细胞分离，抗体染色，细胞分选和分选后）中将样品置于冰上至关重要。
由于肺部样本可能发粘，因此除了在组织分离过程中进行双重过滤以防止堵塞细胞分选器之外，在分选之前立即对其进行过滤也很重要。

菜谱

感染缓冲液（无菌过滤器）
0.01％吐温80

无菌H 2 O

HEPES肺消化缓冲液
注意：来自Sigma-Aldrich的A11 组分。缓冲器也可以直接购买。

2.38 克HEPE S（12.5毫米）

0.203 克MgCl 2 （0.8毫米）

0.373 克KCl （6.25毫米）

8.77 g氯化钠（0.187 M）

0.265 克CaCl 2 · 2H 2 O（2.25毫米）

50 μ 升的NaOH（10 M）

将所有成分添加到2 L桶中的800 ml dH 2 O中。与搅拌棒混合5-10分钟，直到溶解。
通过在50的增量加入NaOH调节pH值至7.40 μ 升。
无菌过滤器，并在室温（最多可存储1年）或4 °C（最多可存储2 年）下存储。定期检查pH。
注意：肺消化缓冲液应为粉红色。如果HEPES缓冲液的pH值错误，则会产生橙色的消化缓冲液。

肺消化缓冲液
注意：每天新鲜。

70 μ 克/毫升的Liberase Blendzyme 3

30 μ 克/毫升DNA酶I

在HEPES Buffer 中弃用（请参见上文）

CFU稀释缓冲液（无菌过滤器）
0.05％吐温80

PBS

FACS缓冲液（储存在4 °C）
1％FBS

0.01％的NaN 3

PBS

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持，授予的奖项为U19AI106761，U19AI135976，U19AI100627和R01AI032972（授予AA）。该mEmerald 菌株是慷慨地提供C. 萨塞蒂和C.贝尔在大学麻省医学院。该协议已开发并在以前的出版物中进行了报道（Rothchild 等，2019）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

伦理

所有实验均按照西雅图儿童研究中心的机构动物护理和使用委员会进行。IACUC00510（活动ID TR00053）下的有效期为6/11 / 2016-6 / 9/2022。

参考文献

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