材料和试剂

1. T75烧瓶

2. 70 µm过滤器

3. 缝合线和针（Ethicon，目录号：SXMD1B105）

4. 酒精垫（Medi Plus，货号：KPN1528）

5. 胰岛素注射器，31 G，0.5 ml（假定为Pic溶液）

6. GentleMACS C试管（GentleMACS TM ，目录号：130-093-237）

7. 麦克风E（NOD / SCID ，8-10周小号老，在这个特定的研究中使用雄性小鼠）

8. 呼玛Ñ啉原点胶质瘤细胞U87MG（ATCC，目录号：HTB-14 TM ）

9. pLenti CMV GFP Puro（Addgene 质粒，目录号：17448）

10. Dulbecco的最低必需培养基（DMEM）高葡萄糖（Biological Industries，目录号：01-055-1）

11. 丙酮酸钠（生物工业，目录号：03-042-B）

12. L-谷氨酰胺（生物工业，目录号：03-020-1B）

13. 胎牛血清（生物工业，目录号：04-001-1A）

14. 青霉素-链霉素溶液（生物产业，目录号：03-031-1B）

15. 胰蛋白酶EDTA溶液（生物工业，目录号：03-050-1A）

16. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Biological Industries，目录号：02-020-1A）

17. 2％氯己定溶液（Ecolab，目录号：3059670）

18. 氯胺酮（Clorketam ，Vetoquinol ）

19. Rimadyl （Carprofen ，目录号：141-053）

20. 眼药膏（Pharmaderm ，目录号：17033-211-38）

21. 甲苯噻嗪（Sedaxylan ，欧罗维特动物健康）。

22. 氯胺酮Xylaxine 混合物，140毫克/千克氯胺酮与10混合毫克/公斤体重量的小鼠的

23. 盐水（布劳恩，目录号：Ecolav PE瓶30毫升）

24. Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，目录号：B2261）

25. 大鼠抗小鼠CD31抗体（BD PharMingen ，目录号：555027）

26. 驴抗大鼠Cy5（Jackson ImmunoResearch Laboratories In c。，目录号：712-605-153）

27. 台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T8154-100ML）

28. 异氟烷（Terrell TM ，Piramal ）

29. 肿瘤分离试剂盒（Miltenyi Biotec ，目录号：130-096-730）

30. RNeasy迷你套件（Qiagen，目录号：74104）

31. FACS缓冲区（请参阅食谱）

32. 血管灌注染料（请参阅食谱）

33. 酶混合物（请参阅食谱）

设备

立体定向机（Stoelting ，目录号：51500D）
带钻头的高速钻机（Stoelting ，目录号：51555）
手术器械一套（世界P recision 我nstruments，目录号：503407）
立体注射器（汉密尔顿，目录号：CAL80301）
组织分离器（GentleMACS TM ，目录号：130-093-235）
荧光显微镜（Nikon，米Odel等：SMZ25）

程序

肿瘤细胞制备
用编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP ）的慢病毒颗粒转导U87MG细胞（滴度：10 7 病毒颗粒/ ml）（Tiscornia 等，2006 ；Huang，2011）。成功转导72小时后，可通过FACS分选获得纯种群。
在加有10％胎牛血清（FBS）和100单位/ ml青霉素/链霉素（PEN-STREP）的DMEM中，在T75烧瓶中的U75MG-GFP细胞中在37℃的潮湿室内培养18-20 h。 °C和5％CO 2 。
用胰蛋白酶消化U87MG-GFP细胞，并以300 xg离心5分钟，吸出培养基并将细胞重悬于1x PBS中。检查生存能力，如果生存能力> 95％，则仅继续进行。准备一个每微升包含10 5个细胞的样品。

肿瘤植入
注意：下文所述的所有程序均应由相应的动物机构使用与护理委员会进行审查和批准。

手术区域必须使用2％洗必泰溶液消毒。手术室应包含以下物品：
带有加热垫的立体定向机器。
带钻头的高速钻。
无菌工具，包括剪刀，手术刀，镊子，带线缝合针。
麻醉，止痛，眼药膏和生理盐水。
70％的乙醇棉签，棉签和纱布。
麻醉的小鼠（8-10我们EKS 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物旧）（140 mg / kg和10mg / kg的体与wt 分别地）。将麻醉后的小鼠（通过脚趾捏合确认）放在加热垫顶部的立体定向机器中，并将小鼠的门牙钩在咬合棒中。消毒顶枕骨上方的背侧区域，直到小鼠的额骨。使用手术刀在头皮中部做一个垂直的长切口，并确认前reg的可视化。确保在手术过程中使用眼药膏以避免眼睛干燥。
在来自前from的以下坐标处在脑半球上钻一个洞：前2毫米，侧面1.5毫米，深3毫米，到达大脑纹状体（图1）。

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图1 。颅内注射示意图。一。通过使用前reg作为参考点确定注射部位，前reg位于冠状缝线与矢状缝线相交处的眼睛和耳朵之间的中轴。乙。通过小鼠大脑冠状切面显示的前reg注射部位的坐标。

将约8 µl U87MG-GFP细胞装入10 µl注射器中，并使用注射泵，以0.5 µl / min的速率在两个瓣上注入2 µl。
接种后，将针头静置5分钟，然后在5分钟内缓慢撤回，以使细胞在注射点沉降。
用无菌骨蜡封住颅骨上的毛刺孔，然后缝合顶部皮肤。连续三天每天皮内注射镇痛药Rimadyl （5 mg / kg）。
术后监测小鼠，直到它们保持正常活动。

染料标记和肿瘤收获
后3周接种，肿瘤植入小鼠，应与血管灌注染料注射（赫斯特33342，5 毫克/公斤体重量）通过尾静脉（静脉内）。
要进行静脉注射，应使用红外线灯将荷瘤小鼠的笼子加热5分钟。取一只鼠标称重。
制备的Hoechst 33342染料（5 毫克/公斤体重量在1只小鼠）X PBS和负载100微升到一个0.5 ml的31 号针附胰岛素注射器。确保装有溶液的注射器中没有气泡。每只小鼠可注射100-200 µl。
将小鼠放在约束器中，然后用酒精纱布擦拭小鼠的尾巴。通过将其靠近红外线灯保持10秒钟来温暖老鼠的尾巴。观察到小鼠的尾静脉已经扩大（血管扩张）。
找到两个侧静脉之一，然后将尾针注入斜尾，并使针几乎与静脉平行，以确保成功（图2），将其注入尾静脉。

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图2. 小鼠尾静脉注射。一。通过小鼠尾静脉注射血管灌注染料（Hoechst 33342）。乙。截面图。Ç 。小鼠尾部循环的解剖结构有助于识别必须注入染料的两条侧静脉之一。

如果针头在静脉中，则在注射时不会产生阻力，一旦注射，静脉就会变白。注入染料，缩回针头，并在注入部位用无菌棉纱网轻轻施加压力，确保出血已停止。
在短暂孵育5-10分钟后（取决于所需标记的程度），用异氟烷麻醉小鼠，并通过颈脱位安乐死小鼠。通过仔细检查头骨并将其放入冰冷的1x PBS中，快速将头部断头并隔离大脑。
在此阶段，血管灌注染料将扩散并染色靠近肿瘤血管的细胞。染料标记5分钟后，灌注染料在功能血管附近的U87MG-GFP异种移植标记细胞中的扩散示意图见图3 。

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图3 。从U87MG-GFP标记的肿瘤异种移植物的肿瘤切片的共聚焦图像在灌注染料（Hoechst 33342）注射5分钟后取回并染色BV（CD31）。注意灌注染料在BVs附近扩散（左图），在肿瘤组织的非灌注区域中不存在。右图显示了整个视野中肿瘤的存在（GFP +细胞）。

在荧光解剖显微镜下，分离肿瘤区域（荧光标记）并进行肿瘤分离。

肿瘤分离
必须使用MACS Miltenyi Biotec的肿瘤分离试剂盒进行肿瘤分离。将肿瘤组织放入冰冷的DMEM中，并将其切成2-4毫米的小块。将肿瘤组织碎片转移到装有酶混合物的温和MACSC 管（配方3）中，并将其安装到温和MACS TM Dissociator中。
通过选择gentleMACS 程序h_tumor_01 开始分离。终止后，使用MACSmix TM 管旋转器在连续旋转下于37 °C 孵育肿瘤样品30分钟。
完成后，再次运行gentleMACS 程序h_tumor_01。将内容物通过70 µm过滤器转移到50 ml试管中，并用冰冷的DMEM溶液补足至30 ml，以终止酶促反应。
以300 x g 离心细胞悬浮液7分钟。吸出上清液，将沉淀重悬于1 ml FACS Buffer中。快速进行FACS排序。

流式细胞仪分选
设置分类策略，首先从混合物中排除死细胞，碎片和双峰（有关门策略的详细信息，请参见图4）。必须进行门控以排除所有基质成分和血细胞（通过对GFP +细胞进行门控，因为癌细胞被荧光标记）。癌细胞可以根据其Hoechst染料摄取量进一步分为不同的子级分，该摄取量与它们与BV的接近程度成正比。

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图4. 用于分离的肿瘤组织的FACS分选的门控策略。门控肿瘤细胞以排除死细胞和碎片（在第一组中标记为黑色）。通过门控策略可确保双峰排除- 绘制侧向散射的高度和宽度，然后对肿瘤细胞群进行正向散射。根据Hoechst染料摄取量，对纯癌细胞进行分级分离。作为一个有代表性的例子，显示了3个癌症亚群，标记为H +具有最高Hoechst染色的亚群，最接近BV，其次是Hm-Hoechst培养基和H- Hoechst阴性人群。

将级分收集到含有DMEM的试管中，以300 xg离心5分钟以收集细胞。
现在，细胞已准备好用于下游测定。这包括制备用于转录组学的RNA，用于代谢组学的代谢物等。此外，这些细胞还可以用于体外或体内功能测定（图5）。
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图5 。小号的协议的电气原理概述及其可能的应用

样品制备
对于转录组学：高质量的RNA至少需要50,000个细胞。使用RNeasy mini试剂盒提取总RNA。在继续生成RNA测序文库之前，可以通过TapeStation 分析RNA的质量。
代谢组：细胞必须迅速在合适的溶剂淬灭[ 例如，我CE冷SOLU 和灰甲醇：乙腈：水（2：5：3）]在20,000g离心XG 用于色谱20分钟，无蛋白质的上清液提取物分离。
对于体外测定，必须在DMEM + 10％FBS培养基中培养细胞。如果目的是将细胞用于体外测定，请确保在无菌条件下完成之前的所有步骤。
对于二次异种移植，计数分选后的存活细胞数，并将皮下注射10 6个细胞或颅内注射10 5个细胞到NOD / SCID小鼠中。

菜谱

FACS缓冲区
1x PBS和1 mM EDTA中的2％FBS

血管灌注染料
Hoechst 33342 5 mg / ml于1x PBS中

酶混合
在2.2 ml DMEM中加入100μl酶H，50μl酶R和12.5μl酶A
使用前将混合物在37 °C 水浴中孵育10分钟

致谢

我们感谢Eli Keshet实验室的成员在该协议标准化过程中提供的有益建议。这项工作得到了DKFZ-MOST研究合作基金（CA-178），欧洲研究委员会高级ERC基金（322692-VASNICHE）以及Eli Keshet的以色列癌症研究基金教授奖的支持。该协议改编自先前发表的工作（Kumar 等人，2019）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

伦理

所有针对动物的实验程序均已获得耶路撒冷希伯来大学生物和生物医学模型权威的批准，并符合IACUC准则。

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