材料和试剂

P ipette提示（赛默飞世尔科技，产品目录编号：QSP液体处理产品110-Q和111-Q ）（吉尔森，目录号：金刚石头DL10 和D5000 ）
1.5 ml塑料管（Rikaken ，目录号：STAR MicroTestTube 1.5 ml RSV-MTT1.5）
0.22 μ 米过滤器（Advantec公司，目录号：13CP020AS）
玻璃管（磐城，货号：TEST18NP ）
无菌50毫升塑料管（Iwaki，目录号2345-050）
BD隼96 - 孔板中，黑色/透明BD Optilux （Becton Dickinson公司，目录号：353948）
96孔白板（Becton Dickinson，目录号：353377）
培养皿（Rikaken ，目录号：STAR SDish9015 ver.2 RSU-SD9015-2）
pLUX 载体（Burton 等人，2010）
特定引物（Thermo Fisher Scientific，定制DNA寡核苷酸）（表1）
TaKaRa Ex Taq （Takara Bio，货号：RR001A）
NucleoSpin 凝胶和PCR 纯化（Macherey -Nagel，目录号：740609.10）
限制性酶Xho I（Takara Bio，目录号：1094）
限制性内切酶Bam HI（Takara Bio，目录号：1010）
In-Fusion HD克隆增强版（Takara Bio，目录号：638920）
卡那霉素单硫酸盐（Nacalai Tesque ，目录号：19839-44）
质粒DNA提取迷你试剂盒（Favorgen ，目录号：FAPDE 001）
的BigDye ® 终结者V3.1准备反应混合物（Applied Biosystems公司，目录号：4337455）
IPTG （Nacalai Tesque ，目录号06289-67）
3 M乙酸钠（Nacalai Tesque ，目录号：06893-24）
乙醇（Nacalai Tesque ，目录号：14710-25）
Hi- Di TM Formamide（Applied Biosystems，目录号：4311320）
Bacto TM 胰蛋白（（BD Biosciences，目录号：211705）
Bacto TM 酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212750），
NaCl（Nacalai Tesque ，目录号：31320-05）
NaOH（Nacalai Tesque ，目录号：31511-05）
Na 2 HPO 4· 12H 2 O（Nacalai Tesque ，目录号：31722-45）
KH 2 PO 4 （和光，目录号：498748161612）
MgCl 2 · 6H 2 O（Nacalai Tesque ，目录号：20908-65）
K 2 SO 4 · 12H 2 O（Nacalai Tesque ，目录号：01727-25）
NH 4 Cl 2 （Nacalai Tesque ，货号：02424-55）
CaCl 2 （Nacalai Tesque ，目录号：08894-25）
D-（+）-葡萄糖（Nacalai Tesque ，目录号：16805-35）
0.5 M EDTA（Nacalai Tesque ，货号：06894-14）
日本国立遗传学研究所提供的感受态大肠杆菌DH5α （使用时的制备方法）（请参阅食谱）
50 mg / ml卡那霉素（请参阅食谱）
LB汤（请参阅食谱）
LB琼脂用50 μ 克/ ml卡那霉素（见配方）
125 mM EDTA（请参阅食谱）
70％乙醇（请参阅食谱）
M9-葡萄糖培养基（请参阅食谱）

设备

移液器（吉尔森，型号小号：移液器P2，P10，P20，P100，P200，P1000，P5000）
Ç entrifuge （和Tomy ，型号：MX-301）
热循环仪（Applied Biosystems，型号：2720Thermal Cycler）
温度室（Taitec ，型号：Thermo Miner SM-10R）
水浴摇床（Taitec ，型号：Personal-11）
DNA测序仪（Applied Biosystems，型号：3500Genetyc Analyzer）
酶标仪（Corona，型号：MTP−880Lab）
高压釜（Tomy Seiko，型号：LSX-500）

软件

Windows的SF6（Corona ，仅日语）
Microsoft Excel（Microsoft ）

程序

pLUX 报告基因质粒的构建
确定目标基因周围的启动子区域。通常，我们从远端转录起始位点上游500个碱基对（bp）到下游150 bp的DNA中获取一个区域（例如，参见确定的18个靶基因的启动子图1）。

D：\ Reformatting \ 2019-12-16 \ 1902843--1273山本和义636874 \ Figs jpg \ Figure1.jpg

图1. 十八大肠杆菌启动子区š 成pLux

设计引物，该引物与pLUX 载体包含1 5个重叠的核苷酸（nt ），用于扩增确定的启动子区域（参见图2和表1）。
使用E x Taq 聚合酶（Takara Bio）通过PCR扩增目标p端区域。标准反应条件是如手册中描述的针对E使用X 的Taq 聚合酶（Takara Bio公司制）。在大多数情况下，热循环条件如如下：在98加热后℃下5分钟，处理的98 30个循环℃下持续10秒（变性），50 ℃下30秒（退火），和72 ° C 1分钟（伸长）（图2）。
通过NucleoSpin Gel和PCR Clean-up（Macherey -Nagel ）纯化PCR产物。
注意：如果PCR产物包括非特异性条带，则在电泳后从琼脂糖凝胶上切下目标产物，并用PCR产物的总体积将其切下，然后通过NucleoSpin Gel和PCR Clean-up（Macherey- Nagel ）纯化。

使用限制酶Xho I和Bam HI 消化pLUX 载体，然后通过NucleoSpin Gel和PCR Clean-up（Macherey -Nagel ）纯化内衬pLUX 。
注：对于克隆到pLUX ，我们建议的双重消化pLUX 双方的Xho I和Bam HI（图URE 2）。

使用In-Fusion HD Cloning Plus（Takara Bio ）将目标启动子作为纯化的PCR产物克隆到内衬pLUX中。
注意：我们建议在体内的大肠杆菌克隆（IVEC ）作为替代DNA克隆方法，该方法是从National提供（Nozaki等人，2019。）生物资源日的项目（NBRP）。

添加部分（〜10 μ 升的IN-FUSION反应混合物的）转换成将0.1ml悬浮液主管的大肠杆菌DH5 α（小号EE ř 在冰上ecipes），然后孵育该混合物30分钟。
将混合物在42 °C 加热45秒，然后立即向混合物中添加0.9 ml LB肉汤。
在37 °C下孵育1 ml 大肠杆菌DH5α 转化子悬浮液60分钟。
传播0.1-0.2毫升的悬浮液的大肠杆菌DH5 α转化到LB琼脂用50 μ 克/ ml卡那霉素，和然后在37孵育琼脂平板℃过夜。
隔离的转化大肠杆菌DH5 α 携带克隆的候选作为单一菌落在LB琼脂用50 μ 克/ ml卡那霉素。
在玻璃管（Iwaki ）中将单个菌落接种到5 ml的含有0.05 ml 50 m g / ml卡那霉素的LB肉汤中，并在37 °C的水浴（Taitec ）中摇动（120 rpm）孵育过夜。
通过质粒DNA提取迷你试剂盒（Favorgen ）从5 ml过夜培养的转化细胞中分离质粒。
桑格反应与分离的质粒作为模板，LUX-R引物（表1），并执行的BigDye ® 根据由推荐过程终结者V3.1准备反应混合物（Applied Biosystems公司）供应商。
转移20 微升桑格产物的进入无菌1.5毫升塑料管中，然后加入2 微升的125mM EDTA，2个微升3M的乙酸钠，和50 微升的乙醇（ナTesque公司）。
通过涡旋混合器将溶液混合15秒。
离心（17,800 xg ，4 °C，15分钟）收集DNA沉淀物。
加入70μl70 ％乙醇，并通过离心（17,800 xg ，4 °C，15分钟）收集DNA沉淀。
由15溶解DNA沉淀微升的HI- 狄TM 甲酰胺（Applied Biosystems）中
用DNA测序仪（Applied Biosystems）确定克隆到分离的质粒中的启动子区域的DNA序列。

D：\ Reformatting \ 2019-12-16 \ 1902843--1273山本和义636874 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2.构建pLUX 报告质粒的策略。使用大肠杆菌K-12基因组作为模板和一对特异性引物，通过PCR扩增启动子区域（表1）。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Takara Bio）将扩增的DNA片段插入pLUX 载体。DH5的转化后α ，将质粒从转化细胞的培养物进行纯化。通过DNA测序确认在所得质粒上的DNA插入序列。

1个

说明：logonew

表1.使用的引物和pLUX 衍生物

名称

表征

参考

底漆

ADIA-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA ATGGGGATATTCCAGCGGGTCATGC -3'（用于adiA 启动子的扩增）

这项研究

ADIA-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC CATTGCTTACCCGGTTATGAAGGAA -3'（用于adiA 启动子的扩增）

这项研究

ADIC-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GAAACTGAGTCAGAAAAGGAACGAA -3'（用于adiC 启动子的扩增）

这项研究

ADIC-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC AATTAAACTCCTGCGAAGGCGAGCT -3'（用于adiC 启动子的扩增）

这项研究

ASCF-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GCACGCGGGAAACGGTCGCTTTTGA -3'（用于扩增ascF 启动子）

这项研究

ASCF-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC CTATCACCGAGCGTGCCAGCGCCGC -3'（用于扩增ascF 启动子）

这项研究

ASCG-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GATGTTATCAACGCCGCCCAGTGCC -3'（用于扩增ascG 启动子）

这项研究

ASCG-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC CCCCCGGCGCGCTTCGCCACTTCCAG -3'（用于扩增ascG 启动子）

这项研究

BGLG-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GACAAATAATTCACCAGACA -3'（用于扩增bglG 启动子）

这项研究

BGLG-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC GTGTTCTTTGCGCACGCGCT -3'（用于扩增bglG 启动子）

这项研究

CADB-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA TTTAATTTACGCCCAGGGGCAAACA -3'（用于cadB 启动子的扩增）

这项研究

CADB-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC GCTCTTCTCCTAATTTCATTTTTGA -3'（用于cadB 启动子的扩增）

这项研究

CADC-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA CGTGCGGCCCCGTGATGCTGTTGAA -3'（用于cadC 启动子的扩增）

这项研究

CADC-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC AATAGAAACTCATTCGAAAAGGGAA -3'（用于cadC 启动子的扩增）

这项研究

CBPA-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA ATTATCATTCTGCATTTCCTCAAAT -3'（用于cbpA 启动子的扩增）

这项研究

CBPA-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC AGCGTTATCTCGCGTAAATCAACAC -3'（用于cbpA 启动子的扩增）

这项研究

DDLA-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GCAAGCTTAAATAACAACTCAGCAA -3'（用于ddlA 启动子的扩增）

这项研究

DDLA-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC CTTAAAAACCTATCCCGTCTAACAC -3'（用于ddlA 启动子的扩增）

这项研究

GADA-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GAAAAAAGACTTTAACTTTGGGGAA -3'（用于扩增gadA 启动子）

这项研究

GADA-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC TTCGAACTCCTTAAATTTATTTGAA -3'（用于扩增gadA 启动子）

这项研究

GADB-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA TCAATATGACGATCCTGCAGC -3'（用于gadB 启动子的扩增）

这项研究

GADB-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC TTTAAACTCCTTAAAATGAT -3'（用于扩增gadB 启动子）

这项研究

GADC-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA CTGGCGGATGAAATCGCCAAACTGG -3'（用于gadC 启动子的扩增）

这项研究

GADC-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC ATTATCCCCCTAAAACGGTATTCCT -3'（用于gadC 启动子的扩增）

这项研究

GLVC-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GCGCACCAGGTAAGTGCCACTACCG -3'（用于glvC 启动子的扩增）

这项研究

GLVC-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC GCACTGGCGTGAACATCGCGCCGCC -3'（用于glvC 启动子的扩增）

这项研究

IRAP-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA TTACCACCAAAAACGATTCCTACCC -3'（用于iraP 启动子的扩增）

这项研究

IRAP-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC GTCTGTATTTCCTTATCCAAAGTAT -3'（用于iraP 启动子的扩增）

这项研究

PAGP-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA GCTGATTAAAATCAAGAAAAACTGC -3'（用于扩增pagP 启动子）

这项研究

PAGP-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC TTGTGACCATAAAACATTTATCAAA -3'（用于扩增pagP 启动子）

这项研究

PROV-LUX-F

5'- TCGTCTTCACCTCGA ATCTCTGGGACAACGTGAAG -3'（用于proV 启动子的扩增）

这项研究

PROV-LUX-R

5'- ACTAACTAGAGGATC CCAGACTGGCGTCTTTTACG -3'（用于proV 启动子的扩增）

这项研究

勒克斯

5'-GGCAGGTAAACACTATTATCACC-3'

Yamanaka 等，2014

pLUX 衍生物

pLUX

无启动子的luxCDABE

伯顿（Burton）等人，2010年

pLUXgadWp

pLUX ，gadW “-lux

伯顿（Burton）等人，2010年

表1. 续

名称

表征

参考

pLUXslpp

pLUX ，SLP “-lux

伯顿（Burton）等人，2010年

pLUXadiAp

pLUX ，adiA -lux （adiA 启动子[434 bp]从adiA p的转录起始位点开始是-399至+35 ）

这项研究

pLUXadiCp

pLUX ，adiC -lux （adiC 启动子[571 bp]从adiC p7的转录起始位点开始是-400至+171 ）

这项研究

pLUXascFp

pLUX ，ascF -lux （ascF 启动子[362 bp]从ascF p的转录起始位点开始是-228至+134 ）

这项研究

pLUXascGp

pLUX ，ascG -lux （从ascG p的转录起始位点开始的ascG 启动子[325 bp]为-325至-1 ）

这项研究

pLUXbglGp

pLUX ，bglG -lux （从bglG p的转录起始位点开始，bglG 启动子[1128 bp]为-164至+964 ）

这项研究

pLUXcadBp

pLUX ，cadB -lux （从cadB p的转录起始位点开始，cadB 启动子[475 bp]为-400至+75 ）

这项研究

pLUXcadCp

pLUX ，cadC -lux （从cadC p的转录起始位点开始，cadC 启动子[429 bp]为-400至+29 ）

这项研究

pLUXcbpAp

pLUX ，cbpA -lux （cbpA 启动子[500 bp]从cbpA p1的转录起始位点开始是-442 至+58 ）

这项研究

pLUXddlAp

pLUX ，ddlA -lux （ddlA 启动子[500 bp]从ddlA 翻译起始密码子的第一个核苷酸开始为-500至-1 ）

这项研究

pLUXgadAp

pLUX ，gadA -lux （gadA 启动子[499 bp]从gadA p的转录起始位点开始是-472至+27 ）

这项研究

pLUXgadBp

pLUX ，gadB -lux （从gadB p的转录起始位点开始，gadB 启动子[500 bp]为-473至+27 ）

这项研究

pLUXgadCp

pLUX ，GADC -lux （所述GADC promotert [500bp的]为-500至-1从翻译起始密码子的核苷酸拳头GADC ）

这项研究

pLUXglvCp

pLUX ，glvC -lux （所述glvC promotert [545 bp的]为-496至+49从翻译起始密码子的核苷酸拳头glvC ）

这项研究

pLUXiraPp

pLUX ，iraP -lux （iraP 启动子[500 bp]从iraP p1的转录起始位点开始是-433至+67 ）

这项研究

pLUXpagPp

pLUX ，pagP -lux （从pagP p的转录起始位点开始，pagP 启动子[500 bp]为-469至+31 ）

这项研究

pLUXproVp

pLUX ，proV -lux （proV 启动子[832 bp]从proV p1的转录起始位点开始是-432至+400 ）

这项研究

在这项研究中构建的质粒可从国家提供生物资源计划（NBRP）大肠杆菌日本的。

大肠杆菌中荧光素酶活性的测定
通过克隆的荧光素酶报告质粒转化大肠杆菌菌株。
注： HNS  HHA  ydgT 菌株，来自大肠杆菌K-12 W3110菌株中分离，缺失三个基因，HNS ，HHA 和ydgT ，在其基因组（Ueda等人，2013）。H-NS在基因的转录沉默中起作用，该基因由大肠杆菌中的Hha 和YdgT 蛋白调节。所述 HNS  HHA  ydgT 菌株用pQE80L，pQE80Lhns携带转化的HNS 基因在pQE80L，pQE80Lhns-I70A携带HNS 与Ile70Ala的取代，或pQE80Lhns-L75A携带基因HNS 与Leu75Ala的取代基因。这些转化体用作荧光素酶测量的宿主。

接种至少三个的单菌落的大肠杆菌转化体在玻璃管中分别下M9葡萄糖培养基中包括50 μ 克/ ml卡那霉素。
注意：除了卡那霉素的，氨苄青霉素应在培养基中，100中的终浓度加入μ 克/毫升的 HNS  HHA  ydgT 应变窝藏pQE80L衍生物和pLux 衍生物。

将预培养物在37°C摇动孵育过夜。
在10 ml含50μg / ml卡那霉素的新鲜M9-葡萄糖培养基中接种100μl 过夜预培养物。
将10 ml培养物在水浴（Taitec ）中于37°C 摇动（120 rpm）孵育，直到测量到萤光素酶活性为止。
转移100 微升培养物到井中的黑色/透明BD隼96 - 一式三份地孔板（Becton Dickinson公司）的每个培养物。
注意：我们测试了96 - 孔平板用于在大肠杆菌中与所述板读数器（电晕）测量发光，表明96 - 孔白色板显示出1.5％的泄漏到相邻的空孔，而96 - 孔黑色板减少泄漏量降低了0.95％（请参见图3中两个96个板的行数据）。尽管通常将白色板用于发光测量，但在本研究中，使用黑色板来防止高发光从一种培养物泄漏到另一孔中。另外，在测量过程中，我们将培养物安排在它们之间的单个孔间隙内，以最大程度地减少向相邻孔的泄漏。但是，我们建议首先使用白板作为标准程序。

D：\ Reformatting \ 2019-12-16 \ 1902843--1273山本和义636874 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3. 在96孔板中测得的大肠杆菌中荧光素酶活性的强度。大肠杆菌K-12 W3110（亲本株）携带pLUXappYp ，含有APPY -lux 操纵子（数据未示出）中生长的M9葡萄糖培养基中，在37 ℃下，将培养物涂布到三个孔（A1，A2，和A3 ）这两个96 - 孔黑色板（Becton Dickinson公司，目录号：353948 ）（上部）和96 - 孔白色板（Becton Dickinson公司，目录号：353377）（低位）。还将M9-葡萄糖培养基（H5，H6和H7）和蒸馏水（H9，H10和H11）分别应用于96孔板的三个孔中。每个强度显示为使用读板仪（Corona）测量的原始数据。在与培养物填充的孔相邻的空孔中检测荧光强度（A4和B1至B4）。

将100μl 新鲜的M9-葡萄糖培养基转移到Ste p B 6中使用的Black / Clear BD Falcon 96孔板（Becton Dickinson）的另一孔中，一式三份。
用读板器（Corona）设置包含样品和背景的Black / Clear BD Falcon 96孔板（Becton Dickinson）。
根据读板器（Corona）的步骤测量OD 600 。
测量发光强度。因此，没有根据读板器（Corona ）的步骤设置过滤器。

数据分析

从Windows的SF6（Corona）中提取OD 600 值和发光强度的原始数值数据作为文本文件。
在Microsoft Excel（Microsoft）中打开一个包含原始数字数据的文本文件。
用背景规格化OD 600 的净值和发光的净强度。
通过以下公式计算发光与OD 600 的比率，作为每种培养物启动子的比活：发光的净强度/ OD 600 的净值。
将一式三份的比率与标准偏差取平均值。
注意：使用的18个启动子的活性如图4所示，表明被H-NS沉默的所有18个启动子均被两个H-NS突变体去除了沉默，这与我们之前的工作一致（Yamanaka et al。，2018）。为了确认显着差异，通过统计分析的t检验计算的p值应评估为小于0.01。

D：\ Reformatting \ 2019-12-16 \ 1902843--1273山本和义636874 \ Figs jpg \ Figure4.jpg

图4.萤光素酶报道基因揭示了大肠杆菌中H-NS对18个启动子的沉默。所述构造18个pLux 报告质粒，pLUXadiAp ，pLUXadiCp ，pLUXascFp ，pLUXascGp ，pLUXbglGp ，pLUXcadBp ，pLUXcadCp ，pLUXcbpAp ，pLUXddlAp ，pLUXgadAp ，pLUXgadBp ，pLUXgadCp ，pLUXgadWp ，pLUXglcVp ，pLUXiraPp ，pLUXpagPp ，pLUXproVp ，和pLUXslpp （表1），引入成 HNS  HHA  ydgT 菌株携带的HNS 质粒（pQE80Lhns，pQE80Lhns-I70A，和pQE80Lhns-L75A）或空质粒（载体pQE80L）。将转化体在M9葡萄糖培养基中生长，用10 μ 中号在37 IPTG ℃下，然后如上述那样计算出的启动子活性。

菜谱

主管大肠杆菌DH5 α
接种的单个菌落的大肠杆菌DH5 α 在5ml LB肉汤
将预培养物在37 °C 摇动孵育过夜
在10毫升新鲜LB肉汤中将过夜预培养稀释100倍
孵育培养物在37 ℃下用SHAK ING直至中期对数生长期
将10 ml培养物转移到50 ml无菌塑料管中（Iwaki）
离心收集细胞（2,300 xg ，4 °C，10分钟）
将细胞悬浮在10 ml的0.1 M CaCl 2 冷水中
在冰上孵育细胞30分钟。
离心收集细胞（2,300 xg ，4 °C，10分钟）
将细胞悬浮于1 ml的0.1 M CaCl 2 冷水中
使用部分（约100 μ 升再悬浮的）大肠杆菌DH5 α 转化
50 mg / ml卡那霉素
将0.5 g卡那霉素单硫酸盐（Nacalai Tesque ）溶于10 ml 蒸馏水中
消毒通过过滤从溶液与0.22 μ 米过滤器（Advantec公司）
将灭菌溶液储存在4 °C
LB肉汤
在800 ml 蒸馏水中溶解10 g Bacto TM 胰蛋白,、 5 g Bacto TM 酵母提取物和10 g NaCl
用NaOH将pH调节至7.5
用蒸馏水将体积调节至1 L
高压灭菌溶液（在LSX-500中设置121 °C 和20分钟）
在室温下储存高压灭菌的LB肉汤
含50μg / ml卡那霉素的LB琼脂
将7.5 g琼脂溶于1 L LB肉汤中
高压灭菌器（在LSX-500中设置121 °C 和20分钟）
添加卡那霉素在50中的最终浓度在冷却之后μ 克/毫升
将培养基倒入培养皿中，然后通过在室温下冷却来硬化LB琼脂
将LB琼脂保存在4 °C
125毫米EDTA
用无菌水将0.5 M EDTA（Nacalai Tesque ）稀释至125 mM
室温保存
70％乙醇
用无菌水将乙醇（Nacalai Tesque ）稀释至70％
室温保存
M9-葡萄糖培养基（高压灭菌，在LSX-500中设置121 °C 和20分钟）
对于5x M9盐（-NH 4 Cl 2 ），将75 g Na 2 HPO 4 ∙12H 2 O，15 g KH 2 PO 4 和0.25 g NaCl溶解在1 L蒸馏水中，然后将溶解的溶液高压灭菌
制备蒸压以下解决方案：2M的NH 4 氯2 ，1M的MgCl 2 ，0.25 MK 2 SO 4 ，10mM的氯化钙2
通过过滤灭菌的1M葡萄糖（0.22 μ 米过滤器）
加入200mL 5×M9盐（-NH 4 氯2 ），将10毫升的2M的NH 4 氯2 ，加入1ml的1M氯化镁的2 ，1毫升0.25 MK 2 SO 4 ，10毫升10毫氯化钙2 ，将10 ml的1 M葡萄糖倒入768 ml的高压灭菌蒸馏水中
室温下保存无菌的M9- 葡萄糖介质

致谢

我们extremel Ÿ感谢晃教授Ishihama ，法政大学，他的意见和手稿的编辑。我们非常感谢Parisa Zangoui Nejad Chahkootahi 博士（新加坡国立大学）和Kyle David Buchan 博士（新加坡国立大学）对本手稿进行了校对。Ť 他pLUX 载体是从彼得·A隆德博士，英国伯明翰大学的礼物。该大肠杆菌 HNS  HHA  ydgT 株是从医生的礼物大沽大岛，富山县立大学。我们感谢法政大学的有田绘里（Eri Arita），长谷川加奈子（Kanako Hasegawa），渡边翔（Sho Watarai），中川英子（Hideko Nakagawa）和福永里藤（Sato Fukunaga）的技术援助。

该协议改编自Burton 等。（2010 ）的方法用于萤光素酶报告基因测定，并由Yamanaka 等人改进。（2018）中的高通量分析方法。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Bjarnason，J.，Southward，CM和Surette，MG（2003）。高通量筛选随机启动子文库中的肠炎沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌中铁反应基因的基因组分析。Ĵ 细菌学185（16）：4973-4982。
伯顿（NA）伯顿（Burton），马里兰州约翰逊（Johnson），安特恰克（Antczak），宾州罗宾逊（A. 通过对转录动力学的研究揭示了大肠杆菌K-12 酸反应网络的新方面。分子生物学杂志401（5）：726-742。
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