摘要:蛋白质的三维结构是理解生物大机器工作机理和药物研发的基石。作为研究蛋白质三维结构的重要手段X射线晶体学近年来也得到了不断发展,但得到高质量的蛋白晶体仍是研究大分子三维结构的瓶颈。对于绝大多数样品来说,在初筛得到蛋白晶体后仍需进行大规模结晶优化工作,其工作量较大,效率也较低。随着科技不断发展,目前已经在蛋白结晶优化方面引入得全自动配液系统,其中Dragonfly是TTP Labtech公司开发的一款全自动微升级液体处理器,它可以准确的抽吸和分配各种类型和不同粘度的液体。易于使用、直观的界面设计使晶体学家能够快速和容易的设置蛋白晶体优化条件,达到快速高效的筛选目的。同时配备有非接触性的一次性DFC枪头和DFC池液槽,也确保了样品零交叉污染。本文以一种信号通路蛋白晶体的优化方案为例,就Dragonfly在蛋白结晶优化中的一般使用方法和流程进行介绍。
关键词: Dragonfly, 池液, 蛋白优化
材料与试剂
- 各种型号枪头 (200 µl, 1 ml)
- 0.22 µm微孔滤器 (赛多利斯)
- 注射器 (江苏治宇医疗器械有限公司)
- 超纯水
- 50 ml离心管 (康宁)
- Magnesium chloride hexahydrate (SIGMA, catalog number: M2393-500G)
- HEPES (VETEC, catalog number: V900479-500G)
- Tris (VETEC, catalog number: V900483-5KG)
- Polyethylene glycol 3,350 (SIGMA, catalog number: 88276-1KG)
- DFC枪头:4150-07100 SPT
- DFC池液槽:4150-07103 SPT
- 96孔晶体板 (Swissci, catalog number: 3W96TUVP)
- 48孔晶体板 (SWISSCI MRC Maxi 48孔板)
- 1 M Hepes缓冲液 (见溶液配方)
- 1 M Tris缓冲液 (见溶液配方)
- 50% PEG3350 (见溶液配方)
- 1 M Mgcl2 (见溶液配方)
仪器设备
- TTP Labtech’s dragonfly®
- 震荡式混匀器 (德国海道夫,model: Titramax 101)
- Mosquito蛋白结晶筛选仪 (TTP Factory, model: Mosquito)
- 体式显微镜 (Nikon, model: SMZ18)
实验步骤
一、以一种信号通路蛋白晶体的优化方案为例来阐述dragonfly的用途 (Jenkins et al., 2014; Pitchai et al., 2016)。
该蛋白样品初筛获得的晶体生长条件有:
- 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M HEPES pH 7.5, 25% w/v Polyethylene glycol 3,350.
- 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M Tris pH 8.5, 25% w/v Polyethylene glycol 3,350.
如图1所示,初筛晶体晶核多,晶体较小,无法进行捞取衍射和数据收集。需在晶体初筛条件的基础上,对晶体条件进一步优化,以得到高质量的蛋白单晶。
图1.初筛获得的晶体图片
二、晶体优化方案的编辑
- 仪器开机,打开控制软件Dragonfly Designer,完成仪器初始化。
- 打开编辑软件Dragonfly Designer,软件将弹出设计窗口。首先,在图2红色区域“components”中添加优化组分,点击“add new”选项,依次填入晶体优化组分的名称,浓度,单位,PH值,池液类型,结果如图3所示。
图2.编辑窗口
图3.添加不同种类优化组分
- 定义区间
根据优化需求,需将板子划分为不同区域,优化组分可以添加在任意区域进行梯度优化。如图4所示,点击“add new”选项,下拉列表中选择预加载的区域,并在“region name”命名区域。本次实验选择“full plate”,“left-half”和“right-half”三个区域。区域可以随意更改和删除。
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图4.创建不同区域
- 区域中添加优化组分,定义浓度梯度
一旦所有区域都规划好,下一步向各个区域添加优化组分,定义组分优化的梯度方向和浓度。具体步骤: - PH梯度优化 (此部分根据优化判断是否需求,如图6所示,此处以Tris为例阐述PH优化方案编辑)
- 一旦所有的组分,区域和渐变都定义好了,切换到export选项卡。首先,“well volume”输入优化体积30 μl,输入最小分配体积,该值仅用于检测;如配发粘度极高的液体,如40% peg8000,则最小配发量应设置为1 μl,否则应保持在0.5 μl。点击“CALCULATE OPTIMISATION”,软件会自动计算出每种组分所需体积;
- 最后,保存编辑好的文件。选择“dragonfly CSV”文件类型以适用dragonfly。文件还可以“PDF”文件和“Text”文件形式保存。
三、池液分装
- 打开控制软件Dragonfly,点击“OPEN”,打开提前保存好的CSV文件。“Plate Type”下拉列表选择所需板型Swiss 96孔板 (此处可任意选择提前定义好的板型,如图7所示),“Well Volume”输入单孔所需池液体积30 μl。“Use Plate-mask”为板子上方加载的防护罩,可防止液体外溅,本实验选择不加。
图7.选择板型
- 进入“set up”界面;
- 将板子放置架子上,A1在左上角方向;
- 切换至Run界面,点击“Run”按钮,开始分液;
- 池液分装完毕,切换至Set up界面,点击“Remove”,待枪头吐出剩余液体,机器回到初始状态,拔出枪头;
- 关闭仪器;
四、二次优化
第一次优化采用坐滴96孔板,96孔板优化的优势:可一次性配制筛选96种不同浓度梯度条件,缺点是液滴体积小,晶体体积相对较小,不易捞取;第二步采用48孔坐滴板进行优化,以获得质量更高更大的蛋白质晶体。具体优化步骤同上。
结果与分析
- 96孔板用微孔板振动筛 (750 x g,1分钟) 混匀池液,用mosquito (200 nl蛋白 + 200 nl池液) 完成结晶重复。两天后观察液滴,对含有晶体的液滴拍照;
- 48孔板用震荡混匀器混匀池液,用mosquito (500 nl蛋白 + 500 nl池液) 完成结晶重复。三天后观察液滴,对含有晶体的液滴拍照;
图10.优化获得的晶体图片
溶液配方
- 1 M Hepes缓冲液
6.057 g粉末溶于50 ml ddH2O,PH调制7.5,0.22 µM滤器过滤除菌,存放4 °C - 1 M Tris缓冲液
11.9 g粉末溶于50 ml ddH2O,PH调制8.5,0.22 µM滤器过滤除菌,存放4 °C - 50% PEG3350
25 g粉末溶于50 ml ddH2O,0.22 µM滤器过滤除菌,存放4 °C - 1 M Mgcl2
4.76 g粉末溶于50 ml ddH2O,0.22 µM滤器过滤除菌,存放4 °C
致谢
本文得到清华大学国家蛋白质研究技术中心的资助。
参考文献
- Jenkins and Cochrane,(2014). Automated protein crystal optimisation with TTP Labtech's dragonfly. Acta Crystallogr A 70, C1743-C1743.
- Pitchai et al.,(2016). Characterization of the NTPR and BD1 interacting domains of the human PICH-BEND3 complex. Acta Crystallogr F 72, 646-651.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:燕宝华, 范仕龙. (2021). 高通量全自动蛋白质晶体优化池液制备方法. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010880. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010880.
How to cite: Yan, B. H. and Fan, S. L. (2021). Automated Protein Crystal Optimisation With TTP Labtech’s Dragonfly Designer
TM. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010880. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010880.