Screening of Active Ingredients from Chinese Herbs Based on Surface Plasmon Resonance   

研究背景

表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR）是一种生物传感分析技术，可以用于研究中药活性成分与靶点在分子水平上的相互作用关系1。SPR技术凭借其出色的实时性、超高的灵敏度以及高专一性等特点，成为了中药活性成分发现的有力工具。在中药活性成分的表征鉴定、分子靶标的筛选、候选药物分子的优化改造以及药物质控等多个环节中，该技术均发挥着不可或缺的重要作用[2–6]。本试验方案以血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）为靶标蛋白，利用BiacoreT200系统，对6种中药进行活性成分筛选，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF-MS）对筛选出的化合物进行分析鉴定，最终确定在葛根中筛选得到活性成分黄豆苷，通过SPR亲和力测定以及酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）确证了其亲和力和生物活性。

材料与试剂

1. CM5芯片（Cytiva，catalog number: 29104988）
2. 氨基偶联试剂盒（Cytiva，catalog number: BR100633）
3. 10 mM醋酸钠缓冲液pH 4.0–5.5（Cytiva，catalog number: BR100349-52）
4. 50 mM NaOH溶液（Cytiva，catalog number: BR100358）
5. 10×HBS-EP+（Cytiva，catalog number: BR100669）
6. 10×PBS buffer（Cytiva，catalog number: BR100672）
7. 三氟乙酸（Adamas，catalog number: 81548K）
8. 碳酸氢铵（Sigma-Aldrich，catalog number: 09830-500G）
9. XBridge BEH C18色谱柱（130Å，2.5 µm，2.1 mm × 100 mm）（Waters，catalog number: 186006031）
10. 质谱纯甲醇（Supelco，catalog number: MX0490）
11. 质谱纯乙腈（Sigma-Aldrich，catalog number: L010100）
12. 质谱纯甲酸（Supelco，catalog number: FX0450）
13. 柴胡、甘草、葛根、桔梗、金银花、青连翘（上海长海医院）
14. 血管紧张素转化酶2（Sino-Biological，10108-H08H）
15. 重组人冠状病毒SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域（Active）（abcam，catalog number: ab273065）
16. 重组抗ACE2中和抗体（Sino-Biological，catalog number: 10108-MM37）
17. 黄豆苷（Tauto-Biotech，catalog number: RM-0024）
18. ELISA通用试剂盒（Biodragon，catalog number: BF06126-2）
    

仪器设备

1. 相互作用分析仪（Cytiva，model: BiacoreT200）
2. 液相色谱系统（Agilent，model: Agilent 1290 Infinity LC）
3. 飞行时间质谱仪（Agilent，model: Agilent 6538 UHD Q-TOF MS）
4. 超纯水制备系统（Millipore，model: Milli-Q A10）
   

实验步骤

一、实验前准备

1. 配体溶液的制备：
   将血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）纯化蛋白冻干粉末溶解在去离子水（ddH₂O）中，制备成1000 μg/mL的ACE2储备液，置于4 °C备用。注意：如果长期不使用，应及时分装并置于-80 °C保存，避免反复冻融。
2. 中药材提取液的制备：
   将葛根（Puerariae Lobatae Radix，PLR）、甘草（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，GRR）、青连翘（Forsythiae Fructus，FF）、柴胡（Bupleuri Radix，BR）、桔梗（Platycodonis Radix，PR）、金银花（Lonicerae Japonicae Flos，LJF）中药材分别处置：首先应用磨粉机将中药材粉碎，通过40目筛网。称取1 g中药材，加入10 mL 80%乙醇溶液，超声提取30分钟后过滤，将过滤液按照12,000 r/min离心15分钟，所得上清液即为中药材提取液，置于4 °C备用。
3. 运行缓冲液和其他溶液的制备：
   HBS-EP+运行缓冲液：量取10× HBS-EP+溶液和ddH₂O，配制成200 mL 1× HBS-EP+溶液；
   PBS稀释液：量取10× PBS溶液和ddH₂O，配制成1,000 mL 1.05× PBS溶液；
   含5% DMSO的PBS运行缓冲液：量取PBS稀释液和DMSO，配制500 mL含5% DMSO的PBS溶液作为中药筛选和亲和力测定的运行缓冲液。
   溶剂校正溶液：用PBS稀释液和DMSO配制4–8个校正溶液，以获得一组DMSO浓度范围为4.5%-5.8%的校正溶液。
   结合成分洗脱液：量取ddH₂O和三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA），配制10 mL 0.5% TFA溶液作为结合成分洗脱液备用，用于回收结合成分；
   结合成分溶解液：精密称取碳酸氢铵（NH₄HCO₃）粉末，用ddH₂O溶解至浓度为50 mM作为结合成分溶解液备用，体积不少于1 mL。
4. 化合物溶液的制备：
   精密称取黄豆苷的标准品，用DMSO溶解至浓度为10 mM，体积约为100 μL，作为化合物储备液，置于4 °C备用。

1. 计算配体偶联水平：
   对于中药筛选，活性成分以小分子化合物为主，分子量可按照500 Da估算。对于亲和力测定，根据分析物的分子量，计算出理论所需的偶联量。本例中ACE2分子量约为85.1 kDa，根据公式计算得出理论偶联量为25,530 RU。
2. 配体的预富集：
   以HBS-EP+为BiacoreT200系统的运行缓冲液。将配体ACE2储备液用不同pH 值（4.0–5.5）的10 mM 醋酸钠缓冲液稀释至终浓度约为20–200 μg/mL。选择“Immobilization pH ”程序，设置流速10 μL/min，进样时间60秒，用50 mM NaOH溶液再生60秒。根据响应情况确定最佳偶联条件，包括缓冲液pH值和配体终浓度。
3. 配体的偶联：
   采用氨基偶联法将配体偶联在CM5芯片表面。根据预富集得到的最佳偶联条件配制配体样品。选择“Immobilization”程序，使用氨基偶联试剂盒，根据计算得出的理论偶联量采用“固定偶联水平”或“固定偶联时间”方法偶联。对于“固定偶联时间”一般设置进样时间为600 s。

1. 活性的测定：
   可以采用低、中、高3个浓度阳性样品快速表征活性，也可以采用亲和力测定法精确测定阳性样品的亲和力以表征活性。对于快速测定，将重组人冠状病毒SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域（Spike protein receptor binding domain，SRBD）蛋白储备液用PBS缓冲液分别稀释至2、20和200 μg/mL。由低浓度到高浓度依次进样，观察其响应值以判断芯片上的ACE2是否具有活性。
2. 特异性的测定：
   以其他不与ACE2结合的蛋白作阴性对照，以稀释液作为空白对照，按上述方法稀释成相应浓度的样品溶液，由低浓度到高浓度的顺序依次进样，观察其在ACE2通道上响应值，若相同浓度下阴性对照、空白对照均与SRBD有显著差异，则判断芯片上ACE2蛋白具有特异性。

1. 样品回收：
   根据初筛结果，使用最佳浓度的中药样品，分别进行进样。采用Biacore T200系统的“Inject and recover”程序回收结合成分。根据初筛响应情况调整各参数，结合时间180 s，流速5 μL/min，结合成分洗脱液（Recovery solution）默认为 0.5% TFA （三氟乙酸），孵育时间（Incubation time）为 20–30 s。结合成分溶解液（Deposition solution）为50 mM NH4HCO3，溶解液体积（Deposition solution volume）为10 μL，重复次数（Number of repetitions）为5。一般循环回收10–20次以便收集到足够量的样品进行质谱检测，最终按照中药种类将回收溶液合并。
2. UHPLC-QTOF-MS分析：
   首先，对各中药的回收样品进行氮气干燥，并将其溶解于100 μL乙腈中。将样品以12000 r/min离心15 min，收集上清液，并将其标记为中药回收溶液。同时，将中药提取液用乙腈释至浓度为10 mg/mL，得到中药稀释液。随后，使用Agilent 1290液相色谱系统对中药回收溶液和中药稀释液进行分析。设置样品体积 5 μL，柱温25 °C。流动相为0.1%甲酸水溶液（A相）和乙腈（B相），梯度洗脱程序为5%B相，持续0–2 min，5–95%B相持续2–17 min，95%B相持续17–19 min。流速为 3.5 mL/min。使用安捷伦 6538 UHD 质谱仪在全扫描模式下检测分离出的化合物。ESI源条件如下：离子检测范围为100–10,00 m/z；干燥气体流量为10 L/min；温度350°C；雾化气体压力为35 psig；毛细管电压4,000 V；和 120 V 的碎片电压。使用安捷伦 MassHunter B.06.00 软件处理和分析色谱数据。
3. 回收成分鉴定：
   从中医综合数据库（TCMID）（http://www.megabionet.org/tcmid/）和草药数据库（HERB）（http://herb.ac.an/）中检索被筛选的中药，收集该中药包含的所有已知中药单体的化学信息，分别统计建立自定义中药数据库。对中药回收液和中药提取液的总离子流图谱进行分子式检索，得到一系列化学分子式。从自定义数据库中检索与这些分子式对应的中药单体的化学信息。购买收集相同分子式的中药单体成分，按照相同的色谱-质谱条件，对中药单体对照品进行分析，将对照品总离子流图谱与中药回收溶液和中药提取液进行比对，检查保留时间和离子的质荷比是否一致，保留时间和质谱信号均相符的成分，可视为筛选出的目标化合物。

1. SPR亲和力测定：
   将目标化合物储备液用PBS稀释液稀释至浓度为128 μM溶液（含5% DMSO）。然后，使用含5% DMSO的PBS运行缓冲液依次稀释至12.8 μM和1.28 μM。按照浓度由低到高的顺序依次注射样品溶液，并随行注射溶剂校正溶液，估算记录各样品校正后的响应值。根据估算结果，选择合适浓度的样品进行亲和力测定，在合适的浓度范围内采用逐级梯度稀释（2倍稀释）法分别设置8–10个不同浓度，以含5% DMSO的PBS进行梯度稀释，采用“Kinetics/Affinity”程序测定化合物的亲和力。
2. ELISA试验：
   采用ELISA通用试剂盒测定化合物对SRBD与ACE2结合的抑制作用。采用方阵滴定法，将SRBD蛋白从2 μg/mL开始，用包被液2倍逐级稀释后进行包被，将ACE2蛋白从1 μg/mL开始，用样品稀释液3倍逐级稀释，确定最佳包被浓度及ACE2饱和浓度。将黄豆苷对照品稀释为含ACE2 0.1 μg/mL、4% DMSO （v/v） 的不同浓度溶液（0.2、2和20 μM）。在SRBD包被的96孔板中依次加入上述溶液100 μL，同时设置ACE2对照孔和空白对照孔，每个浓度设置5个复孔，37 °C反应1 h。洗板后每孔加入100 μL重组抗ACE2中和抗体（1 μg/mL），37 °C反应1 h。洗板后每孔加入100 μL生物素标记二抗，37 °C反应1 h。洗板后每孔加入100 μL辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记亲和素，37 °C反应1 h。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine，TMB）显色液，15 min后终止反应。用酶标仪测定450 nm处的吸光度值，计算化合物的抑制率。

实验注意要点

1. 配体选择：配体不能含有Tris、甘油等影响检测的成分；配体储备液的浓度至少为500 μg/mL，配体溶液稀释倍数应大于10；当配体储备液浓度高于1 mg/mL时，可使用ddH₂O或PBS稀释至1,000 μg/mL或500 μg/mL备用；
2. 最佳配体偶联条件的选择：由于“Immobilization pH”程序中蛋白在芯片中的富集不稳定，非特异性结合的蛋白会使响应偏高，并在“Immobilization”程序的封闭过程中洗脱下来，因此最好选择比计算水平高的预富集偶联值对应的缓冲液pH值和配体终浓度作为最佳偶联条件；
3. 中药材提取液的制备：中药材提取后应高速离心以去除不溶颗粒物，防止样品堵塞管道；进样前应将中药材提取液稀释100–10,000倍，并按照浓度由低到高的顺序依次进样，响应值达到50–100为宜，防止样品浓度过高产生非特异性结合。
4. 洗脱液种类、浓度的选择：结合成分洗脱液（Recovery solution）一般默认为0.5% TFA，也可使用0.2%-1% TFA、甲酸、乙酸或再生溶液等，具体参数可在手动模式下逐一尝试以确定最佳条件。默认酸性洗脱液应搭配使用50 mM NH4HCO3作为结合成分溶解液（Deposition solution）；若使用的是非酸性的洗脱液，结合成分溶解液可以取消或用运行缓冲液代替；
5. 中药材提取液、目标化合物的进样顺序：样品进样顺序需要根据拖尾情况、响应高低、种类数量等多种因素决定。一般情况下，首先考虑将拖尾严重的样品安排在最后进样，拖尾情况相近的样品中选择结合响应较高的后置进样。若样品种类数量较多（>10个）或是需要再生时，可考虑分批进样；
6. 回收循环数的选择：推荐重复回收10–20个循环并合并回收液，以便收集到足够量的样品进行质谱检测。
   

结果与数据分析

一、配体的偶联

 预富集确定最佳ACE2偶联条件为50 μg/mL（pH 4.0），最终偶联响应值为15,166.4 RU，满足中药筛选的要求。

二、芯片活性和特异性

 SARS-CoV-2表面的刺突蛋白是病毒表面的主要抗原成分，其受体结合域SRBD可特异性结合ACE2，因此SRBD可作为阳性对照蛋白；以PBS稀释液作为空白对照，对芯片上ACE2的活性和特异性进行考察，结果如图1所示。可以看出其对注入的不同浓度的ACE2蛋白响应与PBS几乎无明显差异 （图1A），而对SRBD蛋白表现出明显结合，且随SRBD浓度增高，响应值增大 （图1B），说明偶联在芯片上的ACE2蛋白具有特异性和活性。


图1. SPR传感器中偶联蛋白ACE2的特异性与活性鉴定. A：阴性对照（ACE2）；B：阳性对照（SRBD）

三、中药的初筛

 分别将6种中药提取液用PBS稀释1000倍后注入SPR传感器进行初步筛选，结果如图2所示。可以观察到6种中药在ACE2芯片上的响应值具有明显差异。柴胡（BR）、甘草（GRR）、青连翘（FF）和葛根（PLR）响应值较高，桔梗和金银花响应值较低。最终选择响应值相对较高的4种中药用于进一步结合成分的回收。


图2. 六种中药材SPR初筛结果响应值

四、目标化合物的确定

 将回收液和中药提取液样品进行UHPLC-QTOF-MS分析，利用Agilent Qualitative Analysis B.07.00定性分析软件分析回收液与提取液中的共有成分，鉴定出回收液中结合成分的分子式为：C21H20O9，如表1所示。根据建立的自定义库中的中药化学成分信息，初步确定中药提取液中的活性成分为黄豆苷（C21H20O9）。进一步采用对照品对鉴定结果进行确证，发现黄豆苷对照品的保留时间为5.449 min，m/z值为418.1186（[M+H]+），与葛根提取液样品和葛根回收样品中检测到的离子信号一致，因此确定黄豆苷是回收到的结合成分。

表1. UPLC-QTOF-MS鉴定黄豆苷结果

1. SPR亲和力测定
   为了验证筛选得到的成分是否具有结合活性，采用SPR测定黄豆苷与ACE2的亲和力，结果如图3所示。黄豆苷与ACE2结合符合特异性结合的趋势，采用动力学拟合方法计算其亲和力KD为5.18 μM。该结果表明SPR筛选和UHPLC-TOF/MS鉴定结果准确可信，证实黄豆苷是中药葛根中能够与ACE2特异性结合的成分。
   
   
   图3. 黄豆苷与ACE2的亲和力测定
   
   
2. ELISA生物活性测定
   为了进一步验证黄豆苷能否发挥药理作用，采用ELISA测定黄豆苷对SRBD与ACE2结合的影响，不同浓度黄豆苷干预后SRBD与ACE2的结合效率如图4所示。可见不同浓度的黄豆苷均对二者的结合有抑制作用，2 μM黄豆苷的抑制率为37.9%，20 μM黄豆苷的抑制率为38.6%。结果表明，黄豆苷能够抑制SRBD与ACE2的结合，且呈浓度依赖关系，黄豆苷具有抑制SARS-CoV-2进入宿主细胞的潜力。
   
   
   图4. ELISA测定黄豆苷对SRBD-ACE2结合的影响.（**P<0.05）

致谢

国家自然科学基金（82174092），上海市自然科学基金（21ZR1483000、22ZR1476900），上海市浦江人才计划（21PJD083）。

参考文献

1. Lv, D., Xu, J., Qi, M., Wang, D., Xu, W., Qiu, L., Li, Y. and Cao, Y. (2022). A strategy of screening and binding analysis of bioactive components from traditional Chinese medicine based on surface plasmon resonance biosensor. J. Pharm. Anal. 12(3): 500-508. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2021.11.006.
2. Cao, Y., Li, Y. H., Lv, D. Y., Chen, X. F., Chen, L. D., Zhu, Z. Y., Chai, Y. F. and Zhang, J. P. (2016). Identification of a ligand for tumor necrosis factor receptor from Chinese herbs by combination of surface plasmon resonance biosensor and UPLC-MS. Anal. Bioanal. Chem. 408(19): 5359-5367. https://doi.org/10.1007/s00216-016-9633-6.
3. Chen, L., Lv, D., Chen, X., Liu, M., Wang, D., Liu, Y., Hong, Z., Zhu, Z., Hu, X., Cao, Y., et al. (2018). Biosensor-Based Active Ingredients Recognition System for Screening STAT3 Ligands from Medical Herbs. Anal. Chem. 90(15): 8936-8945. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.8b01103.
4. Chen, L., Lv, D., Wang, S., Wang, D., Chen, X., Liu, Y., Hong, Z., Zhu, Z., Cao, Y. and Chai, Y. (2020). Surface Plasmon Resonance-Based Membrane Protein-Targeted Active Ingredients Recognition Strategy: Construction and Implementation in Ligand Screening from Herbal Medicines. Anal. Chem. 92(5): 3972-3980. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b05479.
5. Chen, L., Wang, D., Lv, D., Wang, X., Liu, Y., Chen, X., Zhang, H., Zhu, Z., Hong, Z., Cao, Y., et al. (2019). Identification of eupatilin and ginkgolide B as p38 ligands from medicinal herbs by surface plasmon resonance biosensor-based active ingredients recognition system. J. Pharm. Biomed. Anal. 171: 35-42. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.03.029.
6. Chen, X., Wu, Y., Chen, C., Gu, Y., Zhu, C., Wang, S., Chen, J., Zhang, L., Lv, L., Zhang, G., et al. (2021). Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening. Acta. Pharm. Sin. B. 11(1): 222-236. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2020.10.002.