摘要: 本文以血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)为例,介绍采用表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术筛选中药活性成分的一般过程。首先将ACE2偶联到CM5芯片上,并对芯片的活性和特异性进行评价;其次对6种中药进行提取和初步筛选,发现葛根中存在潜在的结合成分;进一步通过Biacore T200系统“进样和回收”程序对目标中药进行筛选和回收;再利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)分析鉴定回收成分为黄豆苷;最后通过SPR亲和力实验测定黄豆苷与ACE2的解离平衡常数KD为5.18 μM,并通过生物学实验验证其发挥的作用。该方法结果准、效率高,适合中药和其他复杂药物体系的筛选,为中药药效物质和作用机制的研究提供了新方法,也为活性先导化合物的发现和中药新药的开发拓展了新思路。
关键词: 中药, 活性成分, 筛选, 表面等离子共振
研究背景
表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)是一种生物传感分析技术,可以用于研究中药活性成分与靶点在分子水平上的相互作用关系1。SPR技术凭借其出色的实时性、超高的灵敏度以及高专一性等特点,成为了中药活性成分发现的有力工具。在中药活性成分的表征鉴定、分子靶标的筛选、候选药物分子的优化改造以及药物质控等多个环节中,该技术均发挥着不可或缺的重要作用[2–6]。本试验方案以血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)为靶标蛋白,利用BiacoreT200系统,对6种中药进行活性成分筛选,并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)对筛选出的化合物进行分析鉴定,最终确定在葛根中筛选得到活性成分黄豆苷,通过SPR亲和力测定以及酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)确证了其亲和力和生物活性。
材料与试剂
- CM5芯片(Cytiva,catalog number: 29104988)
- 氨基偶联试剂盒(Cytiva,catalog number: BR100633)
- 10 mM醋酸钠缓冲液pH 4.0–5.5(Cytiva,catalog number: BR100349-52)
- 50 mM NaOH溶液(Cytiva,catalog number: BR100358)
- 10×HBS-EP+(Cytiva,catalog number: BR100669)
- 10×PBS buffer(Cytiva,catalog number: BR100672)
- 三氟乙酸(Adamas,catalog number: 81548K)
- 碳酸氢铵(Sigma-Aldrich,catalog number: 09830-500G)
- XBridge BEH C18色谱柱(130Å,2.5 µm,2.1 mm × 100 mm)(Waters,catalog number: 186006031)
- 质谱纯甲醇(Supelco,catalog number: MX0490)
- 质谱纯乙腈(Sigma-Aldrich,catalog number: L010100)
- 质谱纯甲酸(Supelco,catalog number: FX0450)
- 柴胡、甘草、葛根、桔梗、金银花、青连翘(上海长海医院)
- 血管紧张素转化酶2(Sino-Biological,10108-H08H)
- 重组人冠状病毒SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域(Active)(abcam,catalog number: ab273065)
- 重组抗ACE2中和抗体(Sino-Biological,catalog number: 10108-MM37)
- 黄豆苷(Tauto-Biotech,catalog number: RM-0024)
- ELISA通用试剂盒(Biodragon,catalog number: BF06126-2)
仪器设备
- 相互作用分析仪(Cytiva,model: BiacoreT200)
- 液相色谱系统(Agilent,model: Agilent 1290 Infinity LC)
- 飞行时间质谱仪(Agilent,model: Agilent 6538 UHD Q-TOF MS)
- 超纯水制备系统(Millipore,model: Milli-Q A10)
实验步骤
一、实验前准备
- 配体溶液的制备:
将血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)纯化蛋白冻干粉末溶解在去离子水(ddH2O)中,制备成1000 μg/mL的ACE2储备液,置于4 °C备用。注意:如果长期不使用,应及时分装并置于-80 °C保存,避免反复冻融。 - 中药材提取液的制备:
将葛根(Puerariae Lobatae Radix,PLR)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma,GRR)、青连翘(Forsythiae Fructus,FF)、柴胡(Bupleuri Radix,BR)、桔梗(Platycodonis Radix,PR)、金银花(Lonicerae Japonicae Flos,LJF)中药材分别处置:首先应用磨粉机将中药材粉碎,通过40目筛网。称取1 g中药材,加入10 mL 80%乙醇溶液,超声提取30分钟后过滤,将过滤液按照12,000 r/min离心15分钟,所得上清液即为中药材提取液,置于4 °C备用。 - 运行缓冲液和其他溶液的制备:
HBS-EP+运行缓冲液:量取10× HBS-EP+溶液和ddH2O,配制成200 mL 1× HBS-EP+溶液;
PBS稀释液:量取10× PBS溶液和ddH2O,配制成1,000 mL 1.05× PBS溶液;
含5% DMSO的PBS运行缓冲液:量取PBS稀释液和DMSO,配制500 mL含5% DMSO的PBS溶液作为中药筛选和亲和力测定的运行缓冲液。
溶剂校正溶液:用PBS稀释液和DMSO配制4–8个校正溶液,以获得一组DMSO浓度范围为4.5%-5.8%的校正溶液。
结合成分洗脱液:量取ddH2O和三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA),配制10 mL 0.5% TFA溶液作为结合成分洗脱液备用,用于回收结合成分;
结合成分溶解液:精密称取碳酸氢铵(NH4HCO3)粉末,用ddH2O溶解至浓度为50 mM作为结合成分溶解液备用,体积不少于1 mL。 - 化合物溶液的制备:
精密称取黄豆苷的标准品,用DMSO溶解至浓度为10 mM,体积约为100 μL,作为化合物储备液,置于4 °C备用。
二、配体的偶联- 计算配体偶联水平:
对于中药筛选,活性成分以小分子化合物为主,分子量可按照500 Da估算。对于亲和力测定,根据分析物的分子量,计算出理论所需的偶联量。本例中ACE2分子量约为85.1 kDa,根据公式计算得出理论偶联量为25,530 RU。 - 配体的预富集:
以HBS-EP+为BiacoreT200系统的运行缓冲液。将配体ACE2储备液用不同pH 值(4.0–5.5)的10 mM 醋酸钠缓冲液稀释至终浓度约为20–200 μg/mL。选择“Immobilization pH ”程序,设置流速10 μL/min,进样时间60秒,用50 mM NaOH溶液再生60秒。根据响应情况确定最佳偶联条件,包括缓冲液pH值和配体终浓度。 - 配体的偶联:
采用氨基偶联法将配体偶联在CM5芯片表面。根据预富集得到的最佳偶联条件配制配体样品。选择“Immobilization”程序,使用氨基偶联试剂盒,根据计算得出的理论偶联量采用“固定偶联水平”或“固定偶联时间”方法偶联。对于“固定偶联时间”一般设置进样时间为600 s。
三、芯片性能的考察- 活性的测定:
可以采用低、中、高3个浓度阳性样品快速表征活性,也可以采用亲和力测定法精确测定阳性样品的亲和力以表征活性。对于快速测定,将重组人冠状病毒SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合域(Spike protein receptor binding domain,SRBD)蛋白储备液用PBS缓冲液分别稀释至2、20和200 μg/mL。由低浓度到高浓度依次进样,观察其响应值以判断芯片上的ACE2是否具有活性。 - 特异性的测定:
以其他不与ACE2结合的蛋白作阴性对照,以稀释液作为空白对照,按上述方法稀释成相应浓度的样品溶液,由低浓度到高浓度的顺序依次进样,观察其在ACE2通道上响应值,若相同浓度下阴性对照、空白对照均与SRBD有显著差异,则判断芯片上ACE2蛋白具有特异性。
四、中药的初筛将每种中药提取液使用PBS稀释100–10,000倍,得到一系列不同浓度的样品。将每种中药材的稀释样品按照浓度从低到高的顺序依次注入到Biacore T200系统中,记录响应值。根据响应值选取适合的分析浓度(一般以50–100 RU为宜),并比较分析不同中药材同一浓度下的响应值大小,确定初筛结果以及中药筛选顺序。
五、中药的筛选和鉴定- 样品回收:
根据初筛结果,使用最佳浓度的中药样品,分别进行进样。采用Biacore T200系统的“Inject and recover”程序回收结合成分。根据初筛响应情况调整各参数,结合时间180 s,流速5 μL/min,结合成分洗脱液(Recovery solution)默认为 0.5% TFA (三氟乙酸),孵育时间(Incubation time)为 20–30 s。结合成分溶解液(Deposition solution)为50 mM NH4HCO3,溶解液体积(Deposition solution volume)为10 μL,重复次数(Number of repetitions)为5。一般循环回收10–20次以便收集到足够量的样品进行质谱检测,最终按照中药种类将回收溶液合并。 - UHPLC-QTOF-MS分析:
首先,对各中药的回收样品进行氮气干燥,并将其溶解于100 μL乙腈中。将样品以12000 r/min离心15 min,收集上清液,并将其标记为中药回收溶液。同时,将中药提取液用乙腈释至浓度为10 mg/mL,得到中药稀释液。随后,使用Agilent 1290液相色谱系统对中药回收溶液和中药稀释液进行分析。设置样品体积 5 μL,柱温25 °C。流动相为0.1%甲酸水溶液(A相)和乙腈(B相),梯度洗脱程序为5%B相,持续0–2 min,5–95%B相持续2–17 min,95%B相持续17–19 min。流速为 3.5 mL/min。使用安捷伦 6538 UHD 质谱仪在全扫描模式下检测分离出的化合物。ESI源条件如下:离子检测范围为100–10,00 m/z;干燥气体流量为10 L/min;温度350°C;雾化气体压力为35 psig;毛细管电压4,000 V;和 120 V 的碎片电压。使用安捷伦 MassHunter B.06.00 软件处理和分析色谱数据。 - 回收成分鉴定:
从中医综合数据库(TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/)和草药数据库(HERB)(http://herb.ac.an/)中检索被筛选的中药,收集该中药包含的所有已知中药单体的化学信息,分别统计建立自定义中药数据库。对中药回收液和中药提取液的总离子流图谱进行分子式检索,得到一系列化学分子式。从自定义数据库中检索与这些分子式对应的中药单体的化学信息。购买收集相同分子式的中药单体成分,按照相同的色谱-质谱条件,对中药单体对照品进行分析,将对照品总离子流图谱与中药回收溶液和中药提取液进行比对,检查保留时间和离子的质荷比是否一致,保留时间和质谱信号均相符的成分,可视为筛选出的目标化合物。
六、结果验证- SPR亲和力测定:
将目标化合物储备液用PBS稀释液稀释至浓度为128 μM溶液(含5% DMSO)。然后,使用含5% DMSO的PBS运行缓冲液依次稀释至12.8 μM和1.28 μM。按照浓度由低到高的顺序依次注射样品溶液,并随行注射溶剂校正溶液,估算记录各样品校正后的响应值。根据估算结果,选择合适浓度的样品进行亲和力测定,在合适的浓度范围内采用逐级梯度稀释(2倍稀释)法分别设置8–10个不同浓度,以含5% DMSO的PBS进行梯度稀释,采用“Kinetics/Affinity”程序测定化合物的亲和力。 - ELISA试验:
采用ELISA通用试剂盒测定化合物对SRBD与ACE2结合的抑制作用。采用方阵滴定法,将SRBD蛋白从2 μg/mL开始,用包被液2倍逐级稀释后进行包被,将ACE2蛋白从1 μg/mL开始,用样品稀释液3倍逐级稀释,确定最佳包被浓度及ACE2饱和浓度。将黄豆苷对照品稀释为含ACE2 0.1 μg/mL、4% DMSO (v/v) 的不同浓度溶液(0.2、2和20 μM)。在SRBD包被的96孔板中依次加入上述溶液100 μL,同时设置ACE2对照孔和空白对照孔,每个浓度设置5个复孔,37 °C反应1 h。洗板后每孔加入100 μL重组抗ACE2中和抗体(1 μg/mL),37 °C反应1 h。洗板后每孔加入100 μL生物素标记二抗,37 °C反应1 h。洗板后每孔加入100 μL辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记亲和素,37 °C反应1 h。加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3, 3′,5 ,5′-Tetramethylbenzidine,TMB)显色液,15 min后终止反应。用酶标仪测定450 nm处的吸光度值,计算化合物的抑制率。
实验注意要点
- 配体选择:配体不能含有Tris、甘油等影响检测的成分;配体储备液的浓度至少为500 μg/mL,配体溶液稀释倍数应大于10;当配体储备液浓度高于1 mg/mL时,可使用ddH2O或PBS稀释至1,000 μg/mL或500 μg/mL备用;
- 最佳配体偶联条件的选择:由于“Immobilization pH”程序中蛋白在芯片中的富集不稳定,非特异性结合的蛋白会使响应偏高,并在“Immobilization”程序的封闭过程中洗脱下来,因此最好选择比计算水平高的预富集偶联值对应的缓冲液pH值和配体终浓度作为最佳偶联条件;
- 中药材提取液的制备:中药材提取后应高速离心以去除不溶颗粒物,防止样品堵塞管道;进样前应将中药材提取液稀释100–10,000倍,并按照浓度由低到高的顺序依次进样,响应值达到50–100为宜,防止样品浓度过高产生非特异性结合。
- 洗脱液种类、浓度的选择:结合成分洗脱液(Recovery solution)一般默认为0.5% TFA,也可使用0.2%-1% TFA、甲酸、乙酸或再生溶液等,具体参数可在手动模式下逐一尝试以确定最佳条件。默认酸性洗脱液应搭配使用50 mM NH4HCO3作为结合成分溶解液(Deposition solution);若使用的是非酸性的洗脱液,结合成分溶解液可以取消或用运行缓冲液代替;
- 中药材提取液、目标化合物的进样顺序:样品进样顺序需要根据拖尾情况、响应高低、种类数量等多种因素决定。一般情况下,首先考虑将拖尾严重的样品安排在最后进样,拖尾情况相近的样品中选择结合响应较高的后置进样。若样品种类数量较多(>10个)或是需要再生时,可考虑分批进样;
- 回收循环数的选择:推荐重复回收10–20个循环并合并回收液,以便收集到足够量的样品进行质谱检测。
结果与数据分析
一、配体的偶联
预富集确定最佳ACE2偶联条件为50 μg/mL(pH 4.0),最终偶联响应值为15,166.4 RU,满足中药筛选的要求。
二、芯片活性和特异性
SARS-CoV-2表面的刺突蛋白是病毒表面的主要抗原成分,其受体结合域SRBD可特异性结合ACE2,因此SRBD可作为阳性对照蛋白;以PBS稀释液作为空白对照,对芯片上ACE2的活性和特异性进行考察,结果如图1所示。可以看出其对注入的不同浓度的ACE2蛋白响应与PBS几乎无明显差异 (图1A),而对SRBD蛋白表现出明显结合,且随SRBD浓度增高,响应值增大 (图1B),说明偶联在芯片上的ACE2蛋白具有特异性和活性。
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图1. SPR传感器中偶联蛋白ACE2的特异性与活性鉴定. A:阴性对照(ACE2);B:阳性对照(SRBD)
三、中药的初筛
分别将6种中药提取液用PBS稀释1000倍后注入SPR传感器进行初步筛选,结果如图2所示。可以观察到6种中药在ACE2芯片上的响应值具有明显差异。柴胡(BR)、甘草(GRR)、青连翘(FF)和葛根(PLR)响应值较高,桔梗和金银花响应值较低。最终选择响应值相对较高的4种中药用于进一步结合成分的回收。
图2. 六种中药材SPR初筛结果响应值
四、目标化合物的确定
将回收液和中药提取液样品进行UHPLC-QTOF-MS分析,利用Agilent Qualitative Analysis B.07.00定性分析软件分析回收液与提取液中的共有成分,鉴定出回收液中结合成分的分子式为:C21H20O9,如表1所示。根据建立的自定义库中的中药化学成分信息,初步确定中药提取液中的活性成分为黄豆苷(C21H20O9)。进一步采用对照品对鉴定结果进行确证,发现黄豆苷对照品的保留时间为5.449 min,m/z值为418.1186([M+H]+),与葛根提取液样品和葛根回收样品中检测到的离子信号一致,因此确定黄豆苷是回收到的结合成分。
表1. UPLC-QTOF-MS鉴定黄豆苷结果
分子式(理论离子质荷比) | 中药稀释液 | 中药回收溶液 | 化合物 | 中药材 |
保留时间 (min) | 离子质荷比 | 保留时间 (min) | 离子质荷比 |
C21H20O9 418.1194([M+H]+) | 5.445 | 418.1195 ([M+H]+) | 5.571 | 417.1134 ([M+H]+) | 黄豆苷 | 葛根 |
五、目标化合物的活性验证
- SPR亲和力测定
为了验证筛选得到的成分是否具有结合活性,采用SPR测定黄豆苷与ACE2的亲和力,结果如图3所示。黄豆苷与ACE2结合符合特异性结合的趋势,采用动力学拟合方法计算其亲和力KD为5.18 μM。该结果表明SPR筛选和UHPLC-TOF/MS鉴定结果准确可信,证实黄豆苷是中药葛根中能够与ACE2特异性结合的成分。
图3. 黄豆苷与ACE2的亲和力测定
- ELISA生物活性测定
为了进一步验证黄豆苷能否发挥药理作用,采用ELISA测定黄豆苷对SRBD与ACE2结合的影响,不同浓度黄豆苷干预后SRBD与ACE2的结合效率如图4所示。可见不同浓度的黄豆苷均对二者的结合有抑制作用,2 μM黄豆苷的抑制率为37.9%,20 μM黄豆苷的抑制率为38.6%。结果表明,黄豆苷能够抑制SRBD与ACE2的结合,且呈浓度依赖关系,黄豆苷具有抑制SARS-CoV-2进入宿主细胞的潜力。
图4. ELISA测定黄豆苷对SRBD-ACE2结合的影响.(**P<0.05)
致谢
国家自然科学基金(82174092),上海市自然科学基金(21ZR1483000、22ZR1476900),上海市浦江人才计划(21PJD083)。
参考文献
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Q&A
Copyright: © 2024 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:张颖, 王晓飞, 戚敏钰, 胡馨儿, 顾佳钰, 王冬尧, 吕狄亚, 曹岩. (2024). 基于SPR的中药活性成分筛选.
Bio-101: e1011012. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011012.
How to cite: Zhang, Y., Wang, X. F., Qi, M. Y., Hu, X. E., Gu, J. Y., Wang, D. Y., Lv, D. Y. and Cao, Y. (2024). Screening of Active Ingredients from Chinese Herbs Based on Surface Plasmon Resonance.
Bio-101: e1011012. DOI:
10.21769/BioProtoc.1011012.