摘要:高通量siRNA筛选的第一步是将文库中的siRNA试剂高效且低毒地转染至靶细 胞内,转染效果将直接影响筛选结果。影响siRNA转染的条件包括转染方式 (顺式转 染/反式转染)、细胞接种数目、转染试剂的种类及用量、转染时间,siRNA浓度等。本文将以Hela细胞为例详细介绍高通量siRNA文库筛选项目中如何优化siRNA文库的转染条件。
关键词: RNAi筛选, siRNA文库, siRNA转染
研究背景
理想的转染条件需要同时达到两方面要求:一是转染阳性率高,二是转染毒性低。影响siRNA转染效果的因素,包括转染方式、细胞接种数目、转染试剂的种类及用量、转染时间及siRNA浓度等。转染方式 siRNA转染实验共涉及三个元素:细胞、siRNA和转染试剂。根据三个元素加入顺序的不同,转染方法分为顺式转染和反式转染两类 (Persengiev et al., 2004) (表1)。在反式转染的步骤中,先将siRNA加入多孔板中,然后加入转染试剂。转染复合物形成之后,加入细胞悬液。顺式转染则相反,先在孔中加入细胞,细胞贴壁后加入siRNA和转染试剂形成的转染复合物。对于高通量实验,反式转染是首选的转染方式,因为:1) 铺细胞和转染一步完成,自动化步骤简便,可实现更高通量;2) 不需要在一块单独的板上制备siRNA-转染试剂复合物再转移至细胞板内,节约了耗材成本;3) siRNA文库可提前制备好并储存在孔板中冰箱保存,筛选实验开展前溶解后可直接使用,文库制备和筛选实验开展的时间安排相对灵活。表1. 顺式转染与反式转染细胞接种数目 细胞接种数目的确定需要同时考虑两方面的因素:第一,研究者所关注的生物学表型对细胞密度的要求。例如,筛选细胞增殖的调控基因时,需尽量保证整个实验过程中细胞处于增殖状态,若过早达到接触抑制会导致丢失阳性基因,因此起始的细胞接种密度不可过高;而在利用划痕实验 (wound-healing) 鉴定细胞迁移调控因子的筛选实验中 (Wang et al., 2019),需要保证划痕时细胞密度达到90%-100%,以排除细胞增殖对细胞迁移表型的影响。第二,不同细胞密度对转染试剂的耐受程度。转染试剂往往存在一定的细胞毒性,尤其在细胞密度过低时毒性更加显著。因此,在符合生物学表型对细胞密度要求的前提下,可尽量增加细胞接种数目,以降低转染毒性。转染试剂 转染试剂的优化主要涉及转染试剂种类和用量。不同细胞类型适用的转染试剂种类不同。我们常用的siRNA转染试剂包括DharmaFECT及Lipofectamin RNAiMAX,均属于脂质体类转染试剂。每孔转染试剂的用量需要同时考虑转染效率、转染毒性及高通量筛选的成本。提高转染试剂的用量可以部分程度上提高转染效率,但同时会增加转染毒性及筛选成本。因此,需要综合考虑转染效率和转染毒性,在保证转染效率的情况下,选用尽可能低浓度的转染试剂。转染孔的细胞密度或细胞活力保持在无转染试剂对照孔的80%以上,一般被认为是转染毒性可接受的条件。转染时间及siRNA浓度 我们利用Dharmacon公司的全基因组siRNA文库开展RNAi筛选时,siRNA的工作浓度一般选择20 nM,转染后48-96 h开展检测。转染时长的确定要同时考虑siRNA下调靶基因mRNA水平到靶基因蛋白水平实现下调的时间,以及所检测表型对时长的要求。若筛选体系有已知的阳性基因,可根据阳性基因siRNA出现表型的时长确定筛选体系的时长。反式转染是高通量siRNA筛选的主要转染方式,下文重点介绍反式转染的条件优化方法。若反式转染效率不高的细胞,可开展顺式转染条件的优化,需要优化的因素及孔位排布设计与反式转染类似。优化转染条件我们一般使用转染指示剂TOX,该siRNA进入绝大多数种类的细胞后会导致细胞死亡。若所用细胞对TOX不敏感,可选用带荧光的siRNA,通过观察进入细胞内的siRNA的荧光强度来判断转染效率。下文以TOX作为转染指示剂为例介绍反式转染优化方法。
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
结果与分析
致谢
感谢中科院分子细胞科学卓越创新中心化学生物学技术平台全体成员的建议和帮助。本工作得到中科院关键技术人才项目 (Y907S21A11) 的资助。
参考文献
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