摘要:固有免疫是机体面对病原入侵时启动的第一道屏障,其中的cGAS-STING信号通路是主要的DNA固有免疫通路 (Wu et al., 2012)。核心蛋白环鸟苷酸-腺苷酸合成酶 (cyclic GMP-AMP synthase, cGAS) 是一种胞质DNA感受器,能够识别并结合存在于细胞质中的双链DNA,催化ATP与GTP合成第二信使2’,3’-cGAMP (Gao et al., 2013; Sun et al., 2013),激活下游干扰素刺激因子 (Stimulator of interferon gene, STING),STING招募TBK1以激活干扰素调节因子IRF3和NF-κB,并诱导I型干扰素和其它免疫应答基因的表达,进而激活机体固有免疫反应 (Civril et al., 2013; Du et al., 2018)。cGAS的异常激活被认为与各种自身免疫性疾病有关,因此,高活性与特异性的cGAS小分子抑制剂具有成为自身免疫性疾病治疗药物的潜质 (Lama et al., 2019)。另一方面,体外高通量筛选的方法,是小分子抑制剂开发中获得先导化合物的经典手段。本文详细描述了对cGAS抑制剂进行体外高通量筛选的方法,该方法基于体外生化实验检测cGAS底物ATP的消耗量,并以此评估cGAS的酶活性的变化,从而进行cGAS小分子抑制剂的筛选。该方法得到的新型cGAS抑制剂先导化合物,将有望作为cGAS依赖性天然免疫途径的小分子化学探针,为相关自身免疫性疾病的研究与治疗提供基础。
关键词: 固有免疫, cGAS, 小分子抑制剂, 体外高通量筛选
材料与试剂
- 384孔细胞培养板 (NEST,catalog number: 761601)
- ATP (Sigma,catalog number: A6559-25UMO)
- GTP (Sigma,catalog number: G8877-25MG)
- HT-DNA (Sigma,catalog number: D6898)
- NaCl (Solarbio,catalog number: S8210)
- MgCl2 (Solarbio,catalog number: M8161)
- ZnCl2 (麦克林,catalog number: Z820759)
- DTT (碧云天,catalog number: ST043-5g)
- PMSF (solarbio, catalog number: P8340-5g)
- Tween-20 (碧云天,catalog number: ST825-500ml)
- Tris (Solarbio, catalog number: T8060)
- Hepes (Solarbio, catalog number: H8090-500g)
- D-luciferin potassium salt (碧云天, catalog number: ST196-25mg)
- 蛋白纯化重悬缓冲液 (见溶液配方)
- 蛋白纯化wash缓冲液 (见溶液配方)
- 阴离子交换柱层析缓冲液 (见溶液配方)
- 凝胶过滤层析缓冲液 (见溶液配方)
- cGAS反应缓冲液 (见溶液配方)
- ATP-LUM检测缓冲液 (见溶液配方)
仪器设备
- ÄKTA蛋白纯化系统 (GE Healthcare, model: ÄKTA pure25)
- 镍离子亲和柱 (GE Healthcare, model: Chelating SepharoseTM Fast Flow)
- 阴离子交换柱 (GE Healthcare, model: MONO Q 5/50 GL)
- 凝胶过滤层析柱 (GE Healthcare, model: Superdex 200 Increase 10/300GL)
- 肝素柱 (GE Healthcare, model: HiTrap Heparin HP 5×5ML)
- 微量离心机 (Thermo scientific, model: LEGEND Micro 21R)
- 高速落地离心机 (Thermo scientific, model: LYNX4000)
- 摇床 (上海旻泉, model: MQD-S2R)
- 高压灭菌锅 (STIK, model: IMJ-78A)
- 超声波细胞破碎仪 (宁波新芝, model: SCIENTZ-IID)
- 移液器 (吉尔森, model: P2/20/200/1000N)
- 多通道移液器 (Eppendorf, model: P100N)
- PCR扩增仪 (杭州博日, model: YC-XP-D)
- 酶标仪 (BioTek, model: cytation3)
- 声波移液系统 (贝克曼库尔特, model: Echo550)
实验步骤
一、目的蛋白表达和纯化
- 将所需目的基因片段克隆到pET28b-His6-SUMO表达载体上,构建重组质粒。
- 将重组质粒转化进入BL21大肠杆菌,37 °C培养单克隆至对数生长期,加入0.3 mM IPTG 16 °C诱导过夜。
- 4 °C,4200 rpm,离心20 min收集过夜培养的细菌。
- 重悬缓冲液重悬菌体,并加入1 mM的PMSF,超声破碎细菌。
- 4 °C,14000 rpm离心50 min,收集上清。
- 镍离子亲和柱进行蛋白纯化,根据需求选择其他蛋白纯化层析柱对蛋白进一步纯化,例如:肝素柱、凝胶层析柱、离子交换柱等。
- 产物使用SDS-PAGE电泳分析。
- 将浓度和纯度较高的蛋白洗脱液混匀后测定蛋白浓度,分装,-80 °C保存。
二、cGAMP合成体系与ATP-LUM检测体系的建立
- 在反应缓冲液中加入hcGAS、HT-DNA (一种双链DNA)、ATP和GTP,使其终浓度分别为100 nM、25 nM、100 μM和100 μM,室温反应。
- 95 °C加热10 min,终止反应。
- 12000 rpm,离心2 min,去除蛋白。
- 通过阴离子交换柱对产物进行分析,验证cGAMP的合成。
- 绘制ATP标准曲线,将ATP从终浓度2 mM开始等倍梯度稀释,分别加入ATP-LUM检测缓冲液,酶标仪检测化学发光读数,对应ATP的浓度,绘制ATP标准曲线。
- 对不同时间点的cGAMP合成反应取样,加入等倍体积的ATP-LUM检测Buffer,酶标仪检测。通过ATP的消耗来检测cGAMP的合成,验证ATP-LUM检测体系。
三、高通量筛选
- 使用声波移液系统Echo550将小分子化合物加入到384孔板1-22列中。
- 每孔加入10 μl 1× 反应缓冲液。
- 取5 μl 4× 反应物混合物 (0.4 mM ATP, 0.4 mM GTP, 0.1 μM HT-DNA, 2 mM DTT) 添加到1-23列的孔中,同时将不含HT-DNA的相同反应混合物 (无酶活性的对照) 添加到24列的孔中。
- 催化反应:加入5 μl 4× hcGAS蛋白 (0.4 μM) 开始反应,室温下反应7 h,并密封平板。
- 高通量检测:加入20 μl ATP-LUM检测缓冲液,酶标仪检测。
结果与分析
- hcGAS 全长 (FL) 蛋白表达和纯化结果
在进行蛋白纯化之前,首先要确定的是目的蛋白是否可以表达。图1展示的是将重组细菌接种到LB培养基,经诱导、破菌、离心后过镍离子亲和柱,然后分别取样,SDS-PAGE电泳分析分析洗脱液中的目的蛋白hcGAS FL。此时的hcGAS FL蛋白结合有DNA,可通过肝素柱进一步纯化除去DNA,如图2。为获的较纯的目的蛋白,我们又用凝胶过滤层析柱对蛋白进行了进一步的纯化,结果如图3所示。表达的蛋白溶解性良好,纯化的蛋白纯度较高,可用于后续cGAMP合成实验。
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图1. hcGAS FL蛋白提取及镍离子亲和柱纯化后SDS-PAGE分析。M: 蛋白分子质量标准;ce: 重组菌总蛋白样品;s: 重组菌超声破碎上清;f: 镍柱流穿液;w: 杂蛋白冲洗液;elu: 目的蛋白洗脱液。
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图2. hcGAS FL蛋白肝素柱层析纯化及SDS-PAGE分析 a. hcGAS FL蛋白肝素柱层析纯化分析图;b. hcGAS FL蛋白肝素柱层析纯化后SDS-PAGE分析图
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图3. hcGAS FL蛋白凝胶层析纯化及SDS-PAGE分析 a. hcGAS FL蛋白凝胶层析纯化分析图;b. hcGAS FL蛋白凝胶层析纯化后SDS-PAGE分析图
- Luciferase蛋白表达和纯化结果
将Luciferase蛋白重组细菌接种到LB培养基,经诱导、超声破菌、离心后过镍离子亲和柱,分别取样后SDS-PAGE电泳分析目的蛋白,结果见图4,Luciferase蛋白表达量较高,溶解性较好。将镍柱洗脱蛋白使用凝胶过滤层析柱进行纯化,结果见图5。SDS-PAGE电泳分析S16-S21蛋白洗脱液,纯度较高,可用于后续ATP-LUM检测反应体系。
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图4. Luciferase蛋白提取及镍离子亲和柱纯化后SDS-PAGE分析。M: 蛋白分子质量标准;ce: 重组菌总蛋白样品;s: 重组菌超声破碎上清;f: 镍柱流穿液;w: 杂蛋白冲洗液;elu: 目的蛋白洗脱液。
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图5. Luciferase蛋白凝胶层析纯化及SDS-PAGE分析 a. Luciferase蛋白凝胶层析纯化分析图;b. Luciferase蛋白凝胶层析纯化后SDS-PAGE分析图
- cGAMP的合成及结果验证
hcGAS蛋白在结合HT-DNA后会催化ATP和GTP生成cGAMP,根据ATP、GTP和cGAMP所带电荷的不同,对离子交换柱的吸附力不同,可用阴离子交换柱将其分开。结果如图6所示,ATP、GTP和cGAMP在阴离子交换柱上的出峰体积分别为22.82 ml、25.70 ml和13.56 ml,因此cGAMP可以在阴离子交换柱上与ATP和GTP分开。随着反应的进行,ATP、GTP被消耗,峰面积减小,cGAMP合成,峰面积增大。
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图6. ATP、GTP和cGAMP通过阴离子交换柱分析图。a. ATP通过阴离子交换柱分析图;b. GTP通过阴离子交换柱分析图;c. cGAMP通过阴离子交换柱分析图;d. abc的merege形式
- ATP-LUM检测cGAMP的合成
ATP-LUM检测体系需要在合适的浓度范围内进行,图7所示为ATP的标准曲线,结果显示:在该体系下,ATP浓度小于125 μM时在标准曲线线性范围内。在ATP标准曲线范围内,基于cGAMP的合成需要消耗ATP,用ATP-LUM检测体系检测cGAMP合成中ATP的剩余量,进而反映不同反应时间cGAMP合成情况。如图8所示,随着反应时间的进行,ATP不断被消耗,化学发光的读数随之降低,该实验说明了cGAMP生成体系和ATP-LUM检测体系都是可行的,同时也说明了cGAS抑制剂体外高通量筛选实验的可行性。
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图7. ATP标准曲线
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图8. ATP-LUM检测体系中ATP的剩余量
- 高通量筛选
图9展示的是hcGAS特异性小分子抑制剂高通量筛选示意图 (Lama et al., 2019),前期cGAMP体外实验的成功合成,为后期体外高通量筛选反应体系提供了实验基础。同时,我们提纯了Luciferase蛋白并建立了ATP-LUM检测体系 (Nakatsu et al., 2006),为体外高通量筛选的检测提供了便捷的实验方法。
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图9. hcGAS特异性小分子抑制剂高通量筛选示意图
溶液配方
- 蛋白纯化重悬缓冲液:50 mM Tris-HCl (pH 8.0),150 mM NaCl,去离子水配制。
- 蛋白纯化wash缓冲液:50 mM Tris-HCl (pH 8.0),150 mM NaCl,20 mM咪唑,去离子水配制。
- 阴离子交换柱层析缓冲液:25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 去离子水配制A液;25 mM Tris-HCl (pH 8.0),1M NaCl去离子水配制B液。
- 凝胶过滤层析缓冲液:25 mM Tris-HCl (pH 8.0),100 mM NaCl,去离子水配制。
- cGAS反应缓冲液:20 mM Tris-HCl (pH 7.4),150 mM NaCl,5 mM MgCl2,1 μM ZnCl2,0.01% Tween-20,去离子水配制。
- ATP-LUM检测缓冲液:0.1 mM luciferin,2 mM ATP,6 mM MgSO4,25 mM HEPES (pH 7.8),0.1 mg/ml luciferase。
致谢
感谢清华大学药学技术中心在高通量药物筛选和质谱鉴定等方面的技术以及平台支持。感谢国家自然科学基金 (项目批准号:32070875 to C.G.Zhang) 的资助。感谢生命中心Tsinghua-Peking Center for Life Sciences的经费支持。
参考文献
- Wu, J. , Sun, L. , Chen, X. , Du, F. and Chen, Z. J. (2012). Cyclic gmp-amp is an endogenous second messenger in innate immune signaling by cytosolic dna. Science 339(6121).
- Gao, P. , Ascano, M. , Wu, Y. , Barchet, W. , Gaffney, B. L. , Zillinger, T. , Serganov, A. A. , Liu, Y. , Jones, R. A. , Hartmann, G. , Tuschl, T. and Patel, D. J. (2013). Cyclic [G(2′,5′)pA(3′,5′)p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase. Cell 153: 1094–1107.
- Sun, L. , Wu, J. , Du, F. , Chen, X. and Chen, Z. J. (2013). Cyclic gmp-amp synthase is a cytosolic dna sensor that activates the type i interferon pathway. Science 339(6121): 786-791.
- Civril, F. , Deimling, T. , Mann, C. C. D. O. , Ablasser, A. and Hopfner, K. P. (2013). Structural mechanism of cytosolic dna sensing by cgas. Nature, advance online publication (7454): 332-337.
- Du, M. and Chen, Z. J. (2018). DNA-induced liquid phase condensation of cGAS activates innate immune signaling. Science 361: 704–709.
- Lama, L. , Adura, C. , Xie, W. , Tomita, D. Kamei, T., Kuryavyi, V., Gogakos, T., et al. (2019). Development of human cgas-specific small-molecule inhibitors for repression of dsdna-triggered interferon expression. Nat Commun 10(1): 2261.
- Nakatsu, T. , Ichiyama, S. , Hiratake, J. , Saldanha, A. , Kobashi, N. , Sakata, K. and Kato, H. (2006). Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature 440(7082): 372-376.
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:侯燕飞, 杨银龙, 张从刚. (2021). hcGAS特异性小分子抑制剂体外高通量筛选. // 高通量筛选实验手册.
Bio-101: e1010857. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010857.
How to cite: Hou, Y.F., Yang, Y.L. and Zhang, C.G. (2021). High-throughput Screening of Human cGAS Specific Small Molecule Inhibitors
in Vitro. // High-throughput Screening Protocol eBook.
Bio-101: e1010857. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010857.