实验原理: DAPI (4,6-联脒-2-苯基吲哚)是一种荧光染料,可以非嵌入方式与细胞核内 DNA链上的A-T碱基对特异性结合,在355nm激光照射下,可以发射400 – 500nm的蓝色 荧光。利用具备 355nm 激光器的流式细胞仪,可以检测到已经标记了 DAPI 染料的细胞核, 实现对植物样品细胞核的倍性的准确分析。
实验目的: 可以检测拟南芥叶片中细胞核的 DNA 含量以及不同倍性。
材料与试剂
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拟南芥叶片
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单面刀片
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尖头镊子
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过滤器,40um(BD)
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记号笔
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流式管,5ml (Falcon)
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冰盒
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培养皿
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DAPI 荧光染料
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预冷的 GS buffer
仪器设备
流式细胞仪 型号:BD FACSAria Fusion
实验步骤
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取样。
用尖头镊子摘取拟南芥植株的子叶 15 对,备用。
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切样。
取 600ul 预冷的 GS buffer 至培养皿中,将培养皿置于冰上。 用尖头镊子将摘好的拟南芥子叶转移至培养皿中的 GS buffer 中。 刀片垂直于样品,快速切样,直至叶肉细胞剥离,叶脉清晰为止。
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过滤。
标记流式上样管。选择 40um 过滤器,将样品过滤至新的培养皿中。
将过滤之后的样品,转移至流式上样管中。
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染色、避光孵育
向样品中加入 DAPI 染料,终浓度 10ug/ml。
避光、冰上孵育 10-15min。
涡旋震荡之后,准备上机检测。
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流式上机检测
选择有 355nm 激光器和 450/40nm 带通滤光片的流式细胞仪检测样品。
实验结果与分析
拟南芥子叶的细胞核经过 DAPI 标记后,表现为多倍性,即图形显示有多个峰, 每个峰代表一个倍性的细胞核。
注意事项
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DAPI 和双链 DNA 结合之后,最大激发波长是 364nm,最大发射波长是 454nm, 所以必须选择有 355nm 激光器和 450/40 带通滤光片的流式细胞仪检测信号。
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为了防止细胞核在制备过程中DNA降解,整个制备过程在冰上操作,GSbuffer 也必须是预冷后使用。
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选择锋利的单面刀片,注意切样的方向和力度,避免过度切碎。
溶液配方
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GS buffer 配方:45mM MgCl2,30mM sodium citrate,20mM MOPS, 0.1%Triton X-100,溶解在 ddH2O 中。
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DAPI 原储液:用无菌水配制成 1mg/ml 的储存液,-20°C保存。
[关键词] 拟南芥,流式,细胞周期
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