摘要:GeoChip是一种高通量基因芯片,包含了编码参与多种地球化学循环 (如,碳循环、氮循环、硫代谢、磷利用、金属抗性、有机物降解等) 的微生物相关功能基因的寡核苷酸探针。目前,最新版的GeoChip 5.0 共有161,961探针,覆盖了1,447个基因家族的超过365,000个基因。与宏基因组测序技术相比,GeoChip芯片技术虽然无法用于未知物种或功能基因的检测,但其对已知功能基因的检测重现性更好,灵敏度更高。因而,GeoChip芯片技术被广泛地应用于土壤、海洋、森林、农田、湖泊、肠道等各种环境微生物群落分析之中,探究微生物群落的代谢途径和功能基因群落结构变化。本文详细介绍了GeoChip芯片实验过程中DNA荧光标记制备、芯片杂交与扫描和数据分析,并列举了相关注意事项,期望能够为开展GeoChip芯片分析环境微生物群落的读者提供一定参考。
关键词: GeoChip, 功能基因, 微生物群落, 芯片, 高通量
材料与试剂
- 各种型号枪头
- 离心管
- PCR管
- DNA 样品 (或cDNA)
- 随机引物Random primer (3 μg/μl random hexamers; Life Technologies,)
- dNTP (5 mM dAGC-TP, 2.5 mM dTTP; GE Healthcare )
- CyDye (25 nM Cy-3 dUTP; GE Healthcare)
- Klenow (imer; 40 U·ml-1; San Diego, CA)
- Klenow buffer (San Diego, CA)
- 双蒸水H2O
- Qiagen QIAquick Kit试剂盒
- 2× HI-RPM hybridization buffer (Thermo Fisher Scientific, USA)
- 10× Acgh Blocking Agent (Thermo Fisher Scientific, USA)
- Formamide (Thermo Fisher Scientific, USA)
- Cot-1 DNA (Thermo Fisher Scientific, USA)
- Universal standard (home-made common oligonucleotide reference standard)
- Wash Buffer 1 (Agilent)
- Wash Buffer 2 (Agilent)
仪器设备
- GeoChip5.0芯片 (180K或者60K)
- 涡旋仪
- 小离心机
- PCR 仪
- 离心机 (配备1.5 ml 转头)
- 恒温水浴锅
- 金属浴恒温仪
- 移液器
- Nanodrop核酸检测仪
- 真空浓缩仪 (Speed Vac;ThermoSavant)
- 恒温箱
- 分子杂交炉 (Shel labs G2545A)
- Agilent SureHyb组件
- 芯片扫描仪NimbleGen MS200 Microarray Scanner (Roche NimbleGen, Madison, WI, USA).
- 磁力搅拌器
实验步骤
- DNA荧光标记
- GeoChip芯片杂交
- GeoChip芯片扫描和数据分析
注意事项
- DNA样品的质量对于荧光标记、芯片杂交和最终的数据质量影响很大,因此尽可能得到高质量的DNA样品是GeoChip芯片分析最关键的第一步。
- 实验过程中用到的荧光染料对光比较敏感,在有条件的情况下尽可能做到避光或者所有实验过程都在暗室中进行。
- 实验过程涉及药品试剂较多,芯片杂交对温度等环境条件比较敏感,为避免批次效应尽量将所有样品在一批或者短时间内处理完成。
- 空气中悬浮颗粒和细小毛絮沾染在清洗后的GeoChip芯片上对后续芯片扫描影响较大 (图1),因而应尽量保证实验环境的清洁。
致谢
本项目由国家自然科学基金项目 (编号:41907209) 和中国博士后科学基金项目 (编号:2018M641327、2019T120101) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41907209), the China Postdoctoral Science Foundation (2018M641327 and 2019T120101)] 支持。
参考文献
- Guo, X., Gao, Q., Yuan, M., Wang, G., Zhou, X., Feng, J., Shi, Z., Hale, L., Wu, L., Zhou, A., Tian, R., Liu, F., Wu, B., Chen, L., Jung, C. G., Niu, S., Li, D., Xu, X., Jiang, L., Escalas, A., Wu, L., He, Z., Van Nostrand, J. D., Ning, D., Liu, X., Yang, Y., Schuur, E. A. G., Konstantinidis, K. T., Cole, J. R., Penton, C. R., Luo, Y., Tiedje, J. M. and Zhou, J. (2020). Gene-informed decomposition model predicts lower soil carbon loss due to persistent microbial adaptation to warming.Nat Commun 11(1): 4897.
- He, Z., Gentry, T. J., Schadt, C. W., Wu, L., Liebich, J., Chong, S. C., Huang, Z., Wu, W., Gu, B., Jardine, P., Criddle, C. and Zhou, J. (2007). GeoChip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical, ecological and environmental processes. ISME J 1(1): 67-77.
- Shi, Z., Yin, H., Nostrand, J. D. V., Voordeckers, J. W., Tu, Q., Deng, Y., Yuan, M., Zhou, A., Zhang, P., Xiao, N., Ning, D., He, Z., Wu, L. and Zhou, J. (2019). Functional gene array-based ultrasensitive and quantitative detection of microbial populations in complex communities. mSystems 4: e00296–00219.
- Tu, Q., Yu, H., He, Z., Deng, Y., Wu, L., Van Nostrand, J. D., Zhou, A., Voordeckers, J., Lee, Y. J., Qin, Y, Hemme, C. L., Shi, Z., Xue, K., Yuan, T., Wang, A. and Zhou, J. (2015). GeoChip 4: a functional gene-array-based high-throughput environmental technology for microbial community analysis. Mol Ecol Resour 14(5): 914-928.
- Zhou, J. Z., Xue, K., Xie, J. P., Deng, Y., Wu, L. Y., Cheng, X. L., Fei, S. F., Deng, S. P., He, Z. L., Van Nostran, J. D. and Luo, Y. Q. (2011). Microbial mediation of carbon-cycle feedbacks to climate warming. Nature Clim Change 2(2): 106-110.
- 卢慧. (2013). 三江源典型高寒草甸不同海拔梯度土壤微生物研究. 硕士学位论文. 青海师范大学
- 谢建平. (2011). 功能基因芯片 (GeoChip) 在两种典型环境微生物群落分析中应用 的研究. 博士学位论文. 中南大学
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Q&A
Copyright: © 2021 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:郭雪, 杨云锋. (2021). 利用GeoChip分析环境微生物功能基因群落结构. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003745. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003745.
How to cite: Guo, X. and Yang, Y. F. (2021). Analysis of Microbial Functional Gene Community Structure in Environmental Samples by GeoChip. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003745. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003745.