人类肠道病毒粒子富集及纳米孔测序   

材料与试剂

1. 0.45 μm PVDF滤器 (Millex-HV)
2. 各种型号枪头
3. 1.5 ml、15 ml、50 ml离心管
4. 超速离心管 (Beckman, catalog number: 355654)
5. TURBO DNase I (Invitrogen, catalog number: AM2238)
6. RNase A (QIAGEN)
7. 10 mM dNTP mix (Promega, catalog number: U1515)
8. M-MLV reverse transcriptase (Promega, catalog number: M1705)
9. Klenow fragment (Taraka, catalog number: 2140A)
10. QIAamp MinElute virus spin kit (QIAGEN, catalog number: 57704)
11. DEPC水 (Ambion, catalog number: AM9922)
12. KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo, catalog number: KOD-201)
13. 琼脂糖 (Invitrogen, catalog number: 75510-019)
14. QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, catalog number: 28704)
15. Ligation sequencing kit (Oxford Nanopore, catalog number: SQK-LSK109)
16. Native barcoding kit (Oxford Nanopore, catalog number: EXP-NBD104)
17. NEBNext FFPE DNA repair mix (NEB, catalog number: M6630L)
18. Ultra II End-prep enzyme mix (NEB, catalog number: E7372AA)
19. Blunt/TA ligase master mix (NEB, catalog number: M0367L)
20. Quick T4 DNA ligase (NEB, catalog number: E6057AA)
21. 核酸染料 (Mei5bio, catalog number: MF079-plus-05)
22. 6x DNA loading buffer (Tiangen, catalog number: RT201-01)
23. Trans 15K DNA marker (全式金生物，catalog number: BM161-01)
24. Primer Rrm (5′-GACCATCTAGCGACCTCCAC - NNNNNN-3′)
25. Primer Rm (5′-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3′)
26. DNA beads (Beckman, catalog number: A63987)
27. Qubit dsDNA HS assay kit (Invitrogen, catalog number: Q32854)
28. Ribonuclease inhibitor (Promega, catalog number: N2515)
29. PBS缓冲液 (见溶液配方)
30. TBE缓冲液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 冷冻离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra^TM X-22R)
2. 高速冷冻离心机 (Thermo Heraeus FERSCO 17 Centrifuge)
3. 超速冷冻离心机 (Beckman Coulter, model: XP-100)
4. 掌上离心机
5. 高压蒸汽灭菌锅
6. PCR仪
7. 凝胶成像系统
8. 电泳仪
9. 恒温水浴锅
10. 超净工作台
11. PromethION测序仪
12. 制胶槽和梳子
13. 手术刀
14. 磁力架
15. 电子天平
16. Qubit^TM 4 Fluorometer

实验步骤

一、 病毒粒子 (VLPs) 富集 (图1)

图1. 病毒富集、核酸提取纯化及测序流程 (Cao等， 2020)

1. 取1~1.5 g粪便于干净无菌的离心管，在15 ml无菌PBS中重悬并充分混匀。
2. 3,000 x g 4 °C离心10 min，取上清于新的无菌的离心管。
3. 重复离心一次。
4. 将上清液用无菌0.45 μm PVDF 滤膜过滤至新的干净无菌的离心管。
5. 将滤液再次用无菌0.45 μm PVDF 滤膜过滤。
6. 滤液转移至灭菌的超速离心管内，加无菌PBS至超过离心管体积2/3处，配平。
7. 180,000 × g 4 °C离心3 h。
8. 弃上清，将离心管倒置在干净吸水纸以流尽残液。
9. 加150 μl无菌PBS重悬沉淀并转移至新的无菌1.5 ml离心管。
10. 250 μl无菌PBS重复冲洗超速离心管并转移至1.5 ml离心管。
11. 加入8 U的TURBO DNase I、45 μl 10x TURBO DNase I buffer和20 U 的RNase A在37 °C下水浴处理30 min。
    
    

二、 病毒核酸提取
处理后的病毒粒子取140~200 μl使用QIAamp MinElute virus spin kit试剂盒提取核酸，剩余病毒粒子-80 °C储存。

三、 反转录为cDNA
取13 μl核酸按照如下体系进行反转录，剩余核酸-80 °C储存。
第一链：

第二链:

四、 PCR扩增
取反转录产物按照如下体系和程序进行PCR扩增，一般为25 μl体系 (为获得足够质量的扩增产物，可增大到200 μl体系)：
体系为：

1. 用1x TBE配制2%浓度琼脂糖胶 (200 ml TBE加4 g琼脂糖)，微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，自来水冷却至约60~70 °C (体感可承受)，加入20 μl核酸染料，摇匀后倒入放有制胶托板的制胶槽中，插入梳子 (300 μl)，冷却凝固 20 min。
2. 将200 μl PCR反应液加入100 μl 3x Loading buffer混匀后全部加入到制好的琼脂糖胶孔中，加入Marker，200 V电泳10 min。
3. 取出琼脂糖胶放入凝胶成像系统中拍照，检查扩增产物目标条带。目的条带回收纯化：参照Marker条带分子量大小，用手术刀在紫外发光仪上切取大于500 bp的条带胶块，参照QIAquick gel extraction kit说明书回收纯化目的基因片段，并用Qubit 4.0检测胶回收产物浓度。
   
   

六、 文库制备及测序
回收后的核酸按照ONT PromthION DNA建库说明书进行基因文库制备和上机测序。


图3. 主要病毒组成及相对丰度 (Cao等， 2020)

注意事项

1. 病毒粒子富集过程中应保证在无菌环境中进行。
2. PBS缓冲液重悬粪便时应充分悬浮，将粪便与食物残渣等冲洗干净，可多次冲洗至上清液色浅澄清后进行下一步离心，也应当注意控制溶液体积。
3. 在超速离心过程中离心管中液体应超过离心管容积的2/3，转速不宜过高，可适当延长离心时间以使病毒粒子沉淀更充分 (Thurber等， 2009)。
4. 病毒核酸在反转录扩增中应避免反复用枪头吹吸，可以选择轻轻拍打的方式混匀。扩增过程为了保证核酸产量，可以扩增50 μl体系四组共200 μl总体系 (Froussard，1993)。
5. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳呈现为弥散条带，为了降低回收胶的重量，选择高浓度琼脂糖凝胶和大电压进行电泳，Marker中500 bp条带充分跑开时即可切胶回收，丢弃小于500 bp的条带，其余条带全部切下回收。回收时裂胶液体积过大，需反复多次添加至同一吸附柱离心。
   

溶液配方

1. TBE缓冲液
   先配制10x TBE缓冲液。称取108 g Tris、7.44 g Na₂EDTA·2H₂O、55 g硼酸，加去离子水800 ml充分溶解，再定容至1 L，121 °C，20 min灭菌后室温保存，使用时用去离子水稀释10倍。
2. PBS缓冲液 (pH 7.2~7.4)：
   称取KH₂PO₄ 0.24 g、Na₂HPO₄ 1.44 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g，加去离子水约800 ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1 L。

致谢

该项工作得到中国国家重点研究发展计划 (批准号2018YFC2000500)，中国科学院战略重点研究计划 (批准号XDB29020000) 和国家自然科学基金 (批准号31771481和91857101) 的支持。

参考文献

1. Cao, J., Zhang, Y., Dai, M., Xu, J., Chen, L., Zhang, F., Zhao, N. and Wang, J. (2020). Profiling of human gut virome with oxford nanopore technology. Medicine in Microecology 4: 100012.
2. Froussard, P. (1993). rPCR: a powerful tool for random amplification of whole RNA sequences. PCR Methods Appl 2(3): 185-190.
3. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L. and Rohwer, F. (2009). Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat Protoc 4(4): 470-483.