Anaerobic High-pressure Cultivation Experiment of Marine Microorganisms   

材料与试剂

1. 注射器 (1 ml, 50 ml)
2. 125 ml 血清瓶
3. 封口钳
4. 血球计数板
5. 蓝色胶塞 (品牌：Chemglass，catalog number: CLS-4208-12)
6. 铝盖
7. 本次实验培养的菌株Pyrococcus yayanosii CH1 (Zeng et al., 2009) 为严格嗜压超嗜热古菌，分离自水深4,100 m的深海热液口
8. 硫单质 (灭菌方法：置于高温培养箱内102 °C 灭菌 1h 后取出，间隔 12 h 以 上，重复102 °C灭菌，重复3次)
9. 酵母提取物
10. 蛋白胨
11. NaCl
12. MgCl₂·6H₂O
13. CaCl₂·2H₂O
14. KCl
15. (NH₄)₂SO₄
16. NaBr
17. SrCl₂
18. Na₂WO₄ 
19. PIPES
20. 去离子水
21. FeCl₃·6H₂O
22. 氮气
23. KH₂PO₄ 
24. K₂HPO₄
25. 刃天青
26. 10% (w/v) Na₂S·9H₂O (pH 7.0) (称取所需的Na₂S·9H₂O，加水适量溶解 (不要超过最终体积的50%)，然后用浓盐酸调节pH至7.0，定容至所需体积，过滤除菌后，厌氧4 °C避光保存)
    

仪器设备

1. 高温高静水压培养装置 (TC4-45M-III，飞宇石油科技，本实验室定制，设计压力60 MPa，工作压力 40 MPa，设计温度 150 °C，工作温度 120 °C)
2. 多通道抽换气装置 (本实验室定制)
3. 普通光学显微镜 (Motic)
   

实验步骤

1. 制备厌氧培养基
   1.1

   在超净台中，用镊子夹取已灭菌的蓝色胶塞，密封装有50 ml TRM培养基的血清瓶。
   1.2

   加装铝盖，并用封口钳密封。
   1.3

   用多通道抽换气装置 (图1A) 进行除氧 (具体操作如下)

   1)

   使用前检查气路管道是否完好无损，真空泵的真空油是否在所需的最低刻 度线之上 (图1C)。

   2)

   该操作系统共有6个抽换气接头，根据需要选择使用的接头数量。用接 头处的针头刺穿厌氧瓶的橡胶塞 (图1D)，打开对应的气路开关。

   3)

   在气柜中打开标识有N₂的钢瓶气开关及管路中相应气体接入的开关。

   4)

   打开真空泵开关，并把抽换气系统的转换开关置于充气位置，开始充N₂，维持5 s；把抽换气系统的转换开关置于抽气位置，开始抽真空，待真空 表指针至 -0.1 MPa时，维持至少20 s (图1B)；重复上述过程3次。

   5)

   系统的关闭按照顺序依次进行如下操作：关闭各抽换气接头对应的开关，关闭真空泵，关闭钢瓶气总阀及各接入点的开关。

   6)

   小心的从厌氧瓶 (管) 橡胶塞中拔出针头，盖好针头保护帽，清理操作台。
   
   
   图1. 多通道抽换气装置图
   
   
   1.4

   用1 ml注射器加入0.5 ml 10% (w/v) Na₂S·9H₂O (pH 7.0) 至终浓度0.1%， 摇匀，静置，直至培养基由红色变为无色。
2. 接种
   用1 ml注射器接种0.5 ml的P. yayanosii CH1对数期种子液至50 ml 厌氧处理后的TRM培养基。
3. 制备厌氧培养试管
   3.1

   在超净台中，取1支50 ml注射器，装上针头，拔出注射器活塞，加入0.5 g 灭菌硫粉，然后将活塞装回注射器，推至底部，排出空气。
   3.2

   用注射器从血清瓶中抽取50 ml已厌氧处理并接种后的培养基，将注射器从血清瓶中拔出。
   3.3

   用镊子折断针头至剩余部分约1 cm，排出注射器中的气泡，将截短的针头扎入已灭菌的蓝色胶塞以密封注射器，备用 (图2)。
   
   
   图2. 制备好的厌氧培养试管示意图
   
   
4. 高温高静水压培养
   4.1

   将制备好的厌氧培养注射器置于TC4-45M-III高温高静水压培养装置的高压釜 腔中 (图1C)，检查水位是否充满高压釜腔体和各接头的密封圈 (即O型圈1 和O型圈2，图1C) 是否完好无损。
   
   
   图3. 高温高静水压装置TC4-45M-III结构图
   
   
   4.2

   旋紧密封头 (图1C)，连接导管至加压系统，并设定使用温度至98 °C (培养釜应加水提前预热至实验所需温度)。
   4.3

   打开阀门1和阀门2 (图1B)，用加压泵向高压釜内注水排出釜内空气，至阀门2出水口 (图1B) 有水持续的流出。
   4.4

   关闭阀门2，加压至实验所需压力 (40 MPa)，关闭阀门1。清理实验台面。
   4.5

   培养结束后，先慢慢打开阀门2 (图1C) 泄压至常压，再拔出密封头 (图1C) 打开高压釜，取出厌氧试管，取样后滴加到血球计数板，在光学显微镜下观察细胞的生长状况并计数。
   4.6

   关闭高压釜的加热装置，清理实验台面。

失败经验

1. 操作者需穿实验服并戴专用隔热手套及护目镜，严禁穿拖鞋、凉鞋及短裤使用高压釜，避免烫伤。
2. 严禁在升压过程中离开仪器。
3. 实验温度和压力应设定在仪器的工作范围之内，TC4-45M-III压力上限为45 MPa。
4. 抽换气仪器气体接入点的气压已经设置为最佳状态 (充气压力为0.15 MPa)，请勿 随意调整减压阀旋钮。
5. 抽换气过程中，确保血清瓶瓶口朝上，防止液体倒吸，损坏系统。
   

溶液配方

1. TRM培养基 (1 L) (Zeng et al., 2009)
   

   酵母提取物	1 g
   蛋白胨	4 g
   NaCl	23 g
   MgCl2·6H2O	5 g
   CaCl2·2H2O	0.02 g
   KCl	0.7 g
   (NH4)2SO4	0.5 g
   NaBr	0.05 g
   SrCl2	0.01 g
   Na2WO4 (10 mM)	1 ml
   PIPES	3.3 g
   KH2PO4 (6% w/v，单独灭菌)	1 ml
   K2HPO4 (6% w/v，单独灭菌)	1 ml
   刃天青（0.1% w/v）	400 µl
   去离子水	至1,000 ml
   pH值	7.0
   灭菌后加入S0	10 g
   FeCl3·6H2O (25 mM)	1 ml

致谢

感谢日本海洋-地球科技研究所的Chiaki Kato和加州大学圣地亚哥分校的Douglas H. Bartlett在微生物高压培养技术上给与的帮助。

参考文献

1. Zeng, X., Birrien, J. L., Fouquet, Y., Cherkashov, G., Jebbar, M., Querellou, J., Oger, P., Cambon-Bonavita, M. A., Xiao, X. and Prieur, D. (2009). Pyrococcus CH1, an obligate piezophilic hyperthermophile: extending the upper pressure-temperature limits for life.ISME J 3(7): 873-876.
2. Zhang, Y., Li, X., Xiao, X. and Bartlett, D. H. (2015). Current developments in marine microbiology: high-pressure biotechnology and the genetic engineering of piezophiles. Current opinion in biotechnology 33: 157-164.