摘要:短链脂肪酸 (Short-chain fatty acids, SCFAs) 是肠道菌群的重要代谢产物,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,对宿主的许多生理代谢过程具有有益的调节作用。由于以往检测方法存在操作耗时长、所需样本量大、机器批次效应偏差、前处理误差大的缺点,无法对样本中的SCFAs进行准确定量。本文通过添加内标脂肪酸的方法,可以在1.5小时内完成粪便样本的前处理手动操作,并且只需0.03 g的粪便样本,完成对十种SCFAs的定量检测。本方法可拓展至其他生物样品类型 (器官组织、微生物培养液等),为肠道菌群代谢相关研究提供技术参考。
关键词: 短链脂肪酸, 气相色谱-质谱技术, 肠道菌群
材料与试剂
材料:
- 0.6 ml离心管
- 气相色谱-质谱上样瓶 (Agilent, catalog number: 5181-0714)
- 内插管 (Agilent, catalog number: 5181-1270)
- 氧化锆珠子 (Biospec, catalog number: 11079110z)
试剂:
- SCFAs混合酸标准品 (Sigma, catalog number: CRM46975)
- 6,6,6-d3己酸 (cdn isotopes, catalog number: ND-3993)
- 无水乙醚 (上海凌峰)
- 无水Na2SO4 (Sigma, catalog number: 238597)
- 盐酸 (上海凌峰)
- N, O-三甲硅烷基三氟乙酰胺 (BSTFA, Sigma, catalog number: 25561-30-2)
仪器设备
- 涡旋振荡器 (赛默飞,Vortex-Genie 2)
- 低温离心机 (艾本德,5427R)
- 通风橱
- 8890-7000D GC-MS
- HP-5 ms色谱柱
实验步骤
一、前期准备工作
按照终浓度配置以下溶液:
- 5 M盐酸
- 10 µg/ml 6,6,6-d3己酸内标溶液 (Cai等,2017)
- 含有10 µg/ml内标的不同梯度浓度SCFAs标准品溶液 (25、50、100、200、400、800 μM)
二、样品前处理
- 取30 mg左右冻存的小鼠粪便于1.5 ml离心管内,加入350 µl内标溶液和10 mg左右氧化锆研磨珠。
- 将离心管水平固定在振荡器圆盘上,4 °C环境中10档高速震荡2 min左右进行匀质,直至形成匀浆状态。
- 将振荡器放置于4 °C环境中,3档低速震荡30 min。
- 4 °C环境中,13,000 x g离心30 min。
- 取100 µl上清至0.6 ml离心管,加入10 µl 5 M盐酸,震荡混匀进行酸化;另取100 µl上清至0.6 ml离心管,标记并于-80 °C冻存备份。
- 加入100 µl无水乙醚,充分震荡混匀,放置冰上5 min (Zhang等,2019)。
- 4 °C环境中,10,000 x g离心5 min。
- 取上层 (乙醚层) 至含有10 mg左右无水Na2SO4的0.6 ml离心管中。
- 再次加入100 µl无水乙醚至剩余溶液中进行第二次和第三次抽提 (重复6-8步2次),将三次抽提的乙醚层抽提溶液混匀震荡,4 °C环境中10,000 x g离心3 min。
- 取160 µl离心后的上层乙醚抽提混合液至内插管中,加入8 µl BSTFA震荡混匀。
- 室温静置超过8 h后,上机检测。检测仪器进样、升温等参数见表1,SIM模式下进行靶标脂肪酸的定性和定量检测见表2。
表1. GC-MS上机检测参数设定
表2. SIM模式下SCFA保留时间和定性定量离子
结果与分析
下图展示了SIM模式下800 μM SCFAs标准品溶液和小鼠粪便样品的检测色谱图 (图1)。
图1. SCFAs标准品和小鼠粪便样品在SIM检测模式下的色谱图
致谢
本文得到青年千人人才计划资助。
参考文献
- Cai, J., Zhang, J., Tian, Y., Zhang, L., Hatzakis, E., Krausz, K. W., Smith, P. B., Gonzalez, F. J. and Patterson, A. D. (2017). Orthogonal Comparison of GC-MS and (1)H NMR Spectroscopy for Short Chain Fatty Acid Quantitation. Anal Chem 89(15): 7900-7906.
- Zhang, S., Wang, H. and Zhu, M. J. (2019). A sensitive GC/MS detection method for analyzing microbial metabolites short chain fatty acids in fecal and serum samples. Talanta 196: 249-254.
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Q&A
Copyright: © 2020 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:刘红宾, 汤锦辉, 戴磊. (2020). 小鼠粪便样本中短链脂肪酸的定量检测. // 微生物组实验手册.
Bio-101: e2003367. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003367.
How to cite: Liu, H. B., Tang, J. H. and Dai, L.
(2020). Quantitative Analysis of Short-chain Fatty Acids (SCFAs) in Mouse Fecal Sample. // Microbiome Protocols eBook.
Bio-101: e2003367. DOI:
10.21769/BioProtoc.2003367.