The Effect of Different Glycosylation Modifications on the Interaction between SARS-CoV-2 S and ACE2（SPR）   

材料与试剂

1. 糖基化修饰RBD (合成方法参照文献Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 12904– 12910，上海交通大学化学化工学院王平教授课题组制备，上海交通大学分析测试中心完成糖基化修饰信息分析，图1)
   
   
   图1. 合成的不同糖基化修饰的RBD蛋白结构示意图[3]
   
   
2. ACE2配体蛋白 (ACROBiosystems，产品目录号: AC2-H5257)
3. 中和抗体AS35 (ACROBiosystems, anti-SARS-CoV-2 spike RBD neutralizing antibody, Human IgG1, 产品目录号: SAD-S35)
4. 中和抗体S309 (合成方法参照文献Cell. 2022 Apr 14;185(8):1389-1401.e18，复旦大学应天雷教授课题组制备[5])
5. WT-RBD (ACROBiosystems, Arg319-Lys537 with His Tag，产品目录号: SPD-C52H1)
6. S系列Protein A芯片 (Cytiva, Series S Sensor Chip Protein A，产品目录号: 29127556)
7. 96孔板 (Cytiva, 产品目录号: BR100503)
8. 96孔板封膜 (Cytiva，产品目录号: 28975816)
9. 10× HBS-EP缓冲液 (Cytiva，产品目录号: BR100669)
10. Glycine 1.5缓冲液 (Cytiva，产品目录号:BR100354)
11. 1.5 mL EP管 (Axygen，产品目录号: BCT-150-C)
12. Zeba^TM 脱盐离心柱 (Thermofisher，产品目录号：89882)
13. 1.0× HBS-EP缓冲液 (见溶液配方)
14. 配体蛋白母液 (见溶液配方)
15. 不同糖基化修饰的RBD蛋白母液 (见溶液配方)
    

仪器设备

1. 纯水仪 (密理博, Milli Q)
2. 表面等离子共振仪 (Cytiva, Biacore 8K)
3. 台式离心机 (赛默飞, Micro21R)

实验步骤

一、实验准备

打开Biacore 8K仪器和控制软件Biacore 8K Control Software（版本号4.0.8.20368），输入软件登录密码。流动池和样品舱的温度均设置为25 ℃。
将仪器右侧标记Buffer A的管路插入1× HBS-EP缓冲液试剂瓶里，将标记Buffer BCD、Water和Reagent的管路插入超纯水的试剂瓶。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块，点击Change chip，点击右侧undock chip，芯片舱打开，拿出维护芯片，按照芯片盒箭头指示方向放入新的Protein A芯片，关闭芯片舱。在仪器控制软件右侧选择New chip，填写芯片相关信息，然后点击Dock chip。
在Biacore 8K Control Software的System setup模块，点击Change solutions，选择Buffer position A，其余默认设置，点击Ready to start。缓冲液会以较高的流速冲洗仪器整个内部流路系统，整个过程耗时6分钟。

二、预实验

（1）计算配体偶联量
根据以下公式计算配体目标偶联量：


其中，R_max为芯片表面最大结合容量，通常设为100 RU；Analyte MW为RBD分子量，ligand MW为ACE2或中和抗体分子量；Sm为化学计量比，通常设成1；R_L为配体偶联量，配体目标偶联量通常设为1.5倍的R_L。在本研究案例中，ACE2或中和抗体分子量为120 kDa和150 kDa，RBD分子量约40 kDa。经公式计算，ACE2或中和抗体蛋白目标偶联量约为450-550 RU。为了降低RBD与ACE2或中和抗体相互作用时的舞蹈效应，我们选择降低ACE2或中和抗体的实际偶联量，控制在300-400RU的范围之内。
（2）结合测试
前期研究工作中，研究者合成不同糖基化修饰的RBD，接下来，使用Biacore 8K对ACE2或中和抗体的固定及其与RBD的结合能力进行了检测。
将ACE2蛋白或中和抗体（S309，AS35）用1× HBS-EP缓冲液稀释成3 µg/mL, 不同糖型的RBD分析物用1× HBS-EP缓冲液稀释成1000 nM。
在Biacore 8K Control Software，点击New method，选择Kinetics/affinity，在Antibody/general里选择 Kinetics/affinity，打开 Multi-cycle kinetics/affinity using capture方法。第一步Method definition，将Concentration unit改成nM，Running buffer设置为HBS-EP，去除Startup步骤。在Analysis里，Capture 的Contact time设置成60 s，Solution 设置为3 µg/ml ACE2或中和抗体。Analyte的Contact time设置成120 s，Dissociation time设置成120 s, 流速30 µL/min。Regeneration的 solution 设置为Glycine 1.5，Contact time设置为60 s，流速30 µL/min。第二步Variables and positioning，use channels选择1-7。在Analysis里，编辑 cycle数为4个，将Analyte Solution改为不同RBD名称，浓度分别设置成0、0、100 nM、100 nM。第三步Cycle overview不需要做任何改动。第四步Plate layout，将样品配好加到96孔板里，其中0浓度和HBS-EP为1× HBS-EP缓冲液。96孔板放到仪器里，点击 Send to queue，点击Ready to start和Save，方法开始运行。在本实验案例中，7个分析物蛋白（不同糖基化修饰的RBD）和3个配体蛋白（ACE2，S309和AS35）需要使用Biacore 8K仪器做三轮实验。
运行结束后，结果表明（1）3 µg/mL ACE2和AS35蛋白在Protein A芯片的偶联量为320-360 RU，满足偶联量要求，因此选择3 µg/mL 作为ACE2和AS35蛋白偶联时使用浓度。3 µg/mL的S306偶联量达到600-650RU，为了降低蛋白偶联量，选择2 µg/mL 作为ACE2和AS35蛋白偶联时的使用浓度。（2）100nM RBD蛋白与ACE2蛋白互作时的结合响应约50-100RU，满足测试需求，因此用100nM RBD蛋白2倍梯度稀释，共8个浓度点。（3）Glycine 1.5能够将系统再生完全，且对Protein A芯片活性影响很小，因此选择Glycine 1.5做为再生试剂，再生时间60 s。

三、亲和力和动力学测试

接下来，使用Biacore 8K对ACE2蛋白或中和抗体与不同糖型的RBD蛋白的亲和力和动力学进行检测。
分别使用1× HBS-EP溶液稀释ACE2蛋白或中和抗体（S309或AS35）至3 µg/mL（ACE2或AS35）或2 µg/ml （S309），再用1× HBS-EP溶液配制蛋白浓度梯度，2倍稀释，共8个浓度点。
在Biacore 8K Control Software，点击New method，选择Kinetics/affinity，在Antibody/general里选择 Kinetics/affinity，打开 Multi-cycle kinetics/affinity using capture方法。第一步Method definition，将Concentration unit改成nM，Running buffer设置为HBS-EP。在Analysis里，Capture 的Contact time设置成60 s，Solution设置为3 µg/mL 配体蛋白（ACE2或AS35）或2 µg/mL S309。Analyte的Contact time设置成120 s，Dissociation time设置成120 s。将Startup里的Analyte设置成和Analysis里完全一样的实验条件。第二步Variables and positioning，在Analysis里，Add cycle至13个循环，将Analyte Solution依次改为分析物名称RBD1、RBD2、RBD3、RBD4、RBD5、RBD6，WT；浓度分别设置成0、0、0.39、0.78、1.5625、3.125、6.25、12.5、12.5、25、50、100、0 nM；在Startup里，Add cycle至5个循环。第三步Cycle overview不需要做任何改动。第四步Plate layout，将样品配好加到96孔板里，其中0浓度和HBS-EP为1× HBS-EP缓冲液。96孔板放到仪器里，点击 Send to queue，点击Ready to start和Save，方法开始运行。
由于Channel 1-8都可以固定ACE2或其他中和抗体蛋白，使用Biacore 8K仪器一次可以完成8个配体分子的动力学测试。在本实验案例中，3个配体分子和7个分析物分子只需要使用Biacore 8K仪器做三轮实验。

实验注意要点

1. 配体偶联：
   用CM5芯片采用氨基偶联方法固定ACE2蛋白时，ACE2蛋白会丧失活性。因此基于直接偶联方法的CM5芯片不适用于固定ACE2蛋白。Protein A芯片能有效捕获含具有Fc片段的配体蛋白，并最大限度保留蛋白活性，因此我们用Protein A 芯片采用捕获法固定含有Fc片段的ACE2蛋白。其他中和抗体由于也具备Fc片段，考虑到实验的一致性，我们也用Protein A芯片固定中和抗体，便于不同样品测试结果之间进行比较。
2. 再生条件摸索：
   由于Protein A 芯片能够耐受Glycine 1.5缓冲液，为保证再生彻底，做蛋白互作实验时可以直接选用Glycine 1.5缓冲液做再生试剂。

结果与数据分析

（1）ACE2或中和抗体与不同糖基化修饰的RBD的亲和力和动力学检测：
使用Biacore 8K的分析软件Biacore Insight Evaluation software对结果进行分析。在Create new evaluation界面，找到要处理的文件，点击Select evaluation method，在Predefined界面，选择Kinetics/affinity里的Antibody/general，双击 Multi-cycle kinetics using capture-Evaluation method。仪器默认会把进样前后的部分曲线截掉，如果不想截掉，点击图右侧的小齿轮，在Remove range里，去掉勾选的Remove ranges at start and end of injections。在Settings中选择Serial，在Kinetics/Affinity mode点击Kinetics，Fit models选择1:1 binding模型，在Initial values里，Rmax选择Fit global，点击Perform fit，即得到拟合结果，包括结合速率ka，解离速率kd，Rmax和亲和力KD。
如图2，结果显示不同糖基化修饰的RBD对其与ACE2的结合没有明显影响。与临床获批的中和抗体 AS35结合力测试表明如果抗体靶点为非糖基化区域，病毒糖基化造成的免疫逃逸效应不明显（图3）。高度保守的以海藻糖为核心的N343糖基化修饰部位是S309识别的主要表位之一。与WT-RBD相比，缺乏海藻糖的RBD与中和抗体S309结合的亲和力显著降低（图4），表明缺乏海藻糖的RBD显著降低了该中和抗体的敏感性。


图2. Biacore 8k检测RBD与ACE2的亲和力和动力学传感图


图3. Biacore 8k检测RBD与中和抗体AS35的亲和力和动力学传感图


图4. Biacore 8k检测RBD与中和抗体S309的亲和力和动力学传感图

溶液配方

1. 1.0× HBS-EP缓冲液
   量取100 mL 10× HBS-EP缓冲液，加900 mL 超纯水，使用0.22 µm过滤器和循环水多用真空泵过滤到装缓冲液的瓶子里。
2. 配体蛋白母液
   利用ZebaTM 脱盐离心柱，按照厂家使用说明用1.0× HBS-EP缓冲液对ACE2和中和抗体AS35与S309进行缓冲液置换。利用BCA方法测试蛋白浓度。
3. 不同糖基化修饰的RBD蛋白母液
   制备的RBD蛋白，溶于1.0× HBS-EP缓冲液，BCA方法测试蛋白浓度。

致谢

感谢上海交通大学化学化工学院王平教授课题组，感谢叶发荣同学的帮助。

参考文献

1. Watanabe, Y., Allen, J. D., Wrapp, D., McLellan, J. S. and Crispin, M. (2020). Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike. Science 369(6501): 330–333. https://doi.org/10.1126/science.abb9983
2. Shajahan, A., Supekar, N. T., Gleinich, A. S. and Azadi, P. (2020). Deducing the N- and O-glycosylation profile of the spike protein of novel coronavirus SARS-CoV-2. Glycobiology 30(12): 981–988. https://doi.org/10.1093/glycob/cwaa042
3. Ye, F., Zhao, J., Xu, P., Liu, X., Yu, J., Shangguan, W., Liu, J., Luo, X., Li, C., Ying, T., et al. (2021). Inside Cover: Synthetic Homogeneous Glycoforms of the SARS‐CoV‐2 Spike Receptor‐Binding Domain Reveals Different Binding Profiles of Monoclonal Antibodies (Angew. Chem. Int. Ed. 23/2021). Angew. Chem. Int. Ed. 60(23): 12610–12610. https://doi.org/10.1002/anie.202104989
4. Pinto, D., Park, Y. J., Beltramello, M., Walls, A. C., Tortorici, M. A., Bianchi, S., Jaconi, S., Culap, K., Zatta, F., De Marco, A., et al. (2020). Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature 583(7815): 290–295. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2349-y
5. Li, C., Zhan, W., Yang, Z., Tu, C., Hu, G., Zhang, X., Song, W., Du, S., Zhu, Y., Huang, K., et al. (2022). Broad neutralization of SARS-CoV-2 variants by an inhalable bispecific single-domain antibody. Cell 185(8): 1389–1401.e18. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.009