摘要：胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI），是指通过显微操作技术将单个精子注入卵母细胞胞浆内，从而使卵母细胞受精的一种辅助生殖技术。与传统的体外受精相比，ICSI对精子活力、数量及受精能力的要求较低，在临床上是第 2 代“试管婴儿”的关键技术。在科研领域，ICSI 可结合其他生物工程技术，制备基因编辑动物模型。此外 ICSI 也是精子冷冻复苏构建受精胚胎的重要辅助手段。本文详细描述了猴胞浆内单精子注射的操作方法及流程。
关键词: 精子, 卵母细胞, 受精, 辅助生殖
材料与试剂
- 3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）
- 3.5 cm 操作皿（FALCON，catalog number: 353001）
- Borosilicate Glass（B100-75-10）
- 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
- 口吸管（北京正天，catalog number：BJ-40）
- 移液枪 （Eppendorf）
- 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）
- 一次性使用无菌注射器带针（KDL 1ml）
- PVP（Sigma，catalog number：PVP360）
- 水银
- TH3液（见溶液配方）
- T3液（见溶液配方）
- HECM9aa培养液（见溶液配方）
- NaCl（Sigma-Aldrich，catalog number：S7653）
- KCl（Sigma-Aldrich，catalog number：P5405）
- CaCl2·2H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：C7902）
- MgCl2·6H2O（Sigma-Aldrich，catalog number：M2670）
- NaH2PO4（Sigma-Aldrich，catalog number：S8282）
- NaHCO3（Sigma-Aldrich，catalog number：S5761）
- HEPES（Sigma-Aldrich，catalog number：H3375）
- D-Glucose（Sigma-Aldrich，catalog number：G7528）
- Sodium Pyruvate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5280）
- Sodium lactate (60% syrup)（Sigma-Aldrich，catalog number：L4263）
- BSA（absin，catalog number：abs9156）
- penicillin-streptomycin (100X)（gibco，catalog number：15070-063）
- PVA（Sigma-Aldrich，catalog number：P8136）
- HCl（沪试，catalog number：7647-01-0）
- Taurine（Sigma-Aldrich，catalog number：T8691）
- Asparagine（Sigma-Aldrich，catalog number：A4159）
- Cysteine（Sigma-Aldrich，catalog number：C7352）
- Histidine（Sigma-Aldrich，catalog number：H6034）
- Lysine（Sigma-Aldrich，catalog number：L5501）
- Proline（Sigma-Aldrich，catalog number：L5607）
- Serine（Sigma-Aldrich，catalog number：S4311）
- Aspartic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：A8949）
- Glycine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8790）
- Glutamic acid（Sigma-Aldrich，catalog number：G8415）
- Glutamine（Sigma-Aldrich，catalog number：G8540）
- Pantothenate（Sigma-Aldrich，catalog number：P5155）
- Phenol Red（Sigma-Aldrich，catalog number：P0290）
仪器设备
- 培养箱（Thermo Scientific，model：Forma 3111、Forma 371）
- 拉针仪（Sutter Instrument，model：P97）
- 断针仪（Narishige，model：MF-900）
- 倒置显微镜（Olympus，model：IX-73）
- 体视显微镜（Olympus，model：SZX7）
- 一对显微操作臂（Narishige）
- 微量注射器（Narishige IM-9B）
- 离心机（Eppendorf centrifuge，model：5702）
- 压电冲击驱动系统（Prime Tech）
实验步骤
实验流程
- 超排母猴及获取卵母细胞；
- 猴子精子的采集与获能处理；
- 完成注射，将卵子移入培养碟中放置培养箱培养；
- 做好详细记录。
单精注射步骤
一、精子获能处理
- 将采集的精子液化15-20 min，取液化好的精子上清加入到15 ml离心管内；
- 在精子离心管内加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
- 离心完后去上清，再加入4 ml的TH3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
- 离心完后去上清，再加入4 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
- 离心完后去上清，再加入2 ml的T3，轻轻吹打，1,800 rpm，离心5分钟；
- 离心完后等待精子上游，上游3分钟；
- 上游后取中层的精子，在培养皿内制备精子滴，盖上矿物油，放入培养箱待用。
二、单精子显微注射
- 将TH3显微注射操作皿做好预热：取200 μl TH3液，在显微操作碟内制备4-5滴TH3液滴和一个柱状TH3液滴，再做一个10% PVP的液滴，每滴体积15-20 μl，并覆盖矿物油；
- 将HECM9aa培养皿做好预热：取200 μl HECM9aa培养液，在培养皿内制备10-13个液滴，每滴体积约15-20 μl，并覆盖矿物油。
- 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为100-110 μm和内径为15-20 μm，打弯成20-30度的持卵针；
- 用拉针仪将1 mm外径的薄壁硼硅酸毛细玻璃管（B100-75-10）拉制成需要的内外径后，在断针仪上断成外径为7-8 μm和内径为5-6 μm，打弯成20-30度的精子注射针；
- 用1 ml注射器从注射针的末端装入1-2 mm水银待用；
- 将制备的显微注射皿放置于载物台上，从低倍视野开始观察整个显微操作滴；
- 将持卵针安装于操作仪左侧的IM9B，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平；
- 将注射针安装于操作仪右侧的piezo压电冲击驱动系统的微注射器上，缓慢深入注射滴中，并调整与操作皿底部水平，保持与持卵针在同一水平线；
- 用胚胎转移管将一组MII期卵母细胞转移到操作皿TH3液滴中，同时将处理的3-5 μl获能精子加到另一个TH3液滴内；
- 镜下在10% PVP内清洗注射针并调整注射针到精子滴中，用注射针尖轻击精子尾部来制动精子后，将精子尾先头后吸入注射针内，移动注射针到放置卵母细胞的注射滴中（当注射针内的精子用完后，重复此步骤）；
- 用持卵针抓取并固定MII期卵母细胞，并调整第一极体在六点或十二点的方向，注射针利用脉冲震荡刺穿破透明带，将精子推到注射针口后通过脉冲震荡辅助注射入卵母细胞内，以尽量少的液体吐出精子；（见图1、图2）
图1. 极体在约 6 点方向，脉冲震荡刺穿破透明带
图2. 精子推到注射针口，准备进行注射
- 完成注射后，持卵针放开卵母细胞；
- 重复上述操作直至完成所有的MII期卵母细胞的精子注射，将胚胎转移到HECM9aa培养液中在 37 °C，5% CO2培养箱中培养；
- 培养箱中培养六个小时以上，在显微镜下检查原核形成情况，出现两个原核的胚胎视为正常受精。（见图3）
图3. 受精卵，箭头所指处为两原核位置注：本文以7只供体数，共获取103枚卵母细胞进行ICSI，其中有91枚正常受精，受精率达88%。（见表1）
表1. ICSI数据统计| 供体数 | 注射卵母细胞数 | 受精数 | 受精率 |
| 1# | 6 | 5 | |
| 2# | 20 | 14 | |
| 3# | 2 | 2 | |
| 4# | 20 | 19 | |
| 5# | 5 | 5 | |
| 6# | 27 | 25 | |
| 7# | 23 | 21 | |
| 总计 | 103 | 91 | 88% |
溶液配方
- Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表2）
表2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
| 成分 | /100ml | /50ml | 备注 |
| NaCl | 3.329 ml | 1.665 ml | 200 mg/ml stock |
| KCl | 239 μl | 119.5 μl | 100 mg/ml stock |
| CaCl2·2H2O | 294 μl | 147 μl | 100 mg/ml stock |
| MgCl2·6H2O | 102 μl | 51 μl | 100 mg/ml stock |
| NaH2PO4 | 48 μl | 24 μl | 100 mg/ml stock |
| NaHCO3 | 210.6 mg | 105.3 mg | |
| HEPES | 240 mg | 120 mg | |
| D-Glucose | 90 mg | 45 mg | |
| Sodium Pyruvate | 12 mg | 6 mg | |
| Sodium lactate (60% syrup) | 0.17 ml | 85 μl | |
| BSA | 300 mg | 150 mg | |
| penicillin-streptomycin (100X) | 1 ml | 500 μl | |
| Phenol Red (0.01%) | 10 μl | 5 μl | |
| pH | 7.4 | |
- Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3)（表3）
表3. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3) 配制表
| 成分 | /100ml | /10ml | 备注 |
| NaCl | 3.329 ml | 333 μl | 200 mg/ml stock |
| KCl | 239 μl | 23.9 μl | 100 mg/ml stock |
| CaCl2·2H2O | 294 μl | 29.4 μl | 100 mg/ml stock |
| MgCl2·6H2O | 102 μl | 10.2 μl | 100 mg/ml stock |
| NaH2PO4 | 48 μl | 4.8 μl | 100 mg/ml stock |
| NaHCO3 | 210.6 mg | 21.06 mg | |
| Glcose | 90 mg | 9 mg | |
| Sodium Pyruvate | 12 mg | 1.2 mg | |
| Sodium lactate (60% syrup) | 0.17 ml | 17 μl | |
| BSA | 300 mg | 30 mg | |
| penicillin-streptomycin (100X) | 1 ml | 100 μl | |
| Phenol Red (0.01%) | 10 μl | 1 μl | |
| pH | 7.4 | |
- HECM-9（表4）
表4. HECM-9 配制表
| 成分 | /100ml | 终浓度 |
| NaCl | 0.6639 g | 113.6 mmol/L |
| KCl | 0.0224 g | 3 mmol/L |
| CaCl2·2H2O | 0.0279 g | 1.9 mmol/L |
| MgCl2·6H2O | 0.0102 g | 0.5 mmol/L |
| NaHCO3 | 0.2100 g | 25 mmol/L |
| Sodium lactate (60% syrup) | 0.0504 g | 4.5 mmol/L |
| PVA | 0.01 g | 0.1 mg/ml |
| 1 mol/L HCl | 0.14 ml | 1.4 mmol/ml |
| 11 AA with Pantothenate | 1 ml | |
| 100X AA stock |
| 成分 | MW | 100X 母液浓度 | 终浓度 |
| Taurine | 125 | 50 mmol/L | 0.5 mmol/L |
| Asparagine | 132 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Cysteine | 121 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Histidine | 155 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Lysine | 146 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Proline | 115 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Serine | 105 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Aspartic acid | 133 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Glycine | 75 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Glutamic acid | 147 | 1 mmol/L | 0.01 mmol/L |
| Glutamine | 146 | 20 mmol/L | 0.2 mmol/L |
| Pantothenate | 238 | 0.3 mmol/L | 3 μmol/L |
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Q&A
Copyright: © 2023 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式：王燕, 许玉婷, 李春杨, 孙强. (2023). 猴胞浆内单精子注射. // 实验动物胚胎操作实验手册.
Bio-101: e1010985. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010985.
How to cite: Wang, Y., Xu, Y. T., Li, C. Y., and Sun, Q. (2023). Intracytoplasmic Sperm Injection of Monkeys. // Embryo Manipulation Manual of Laboratory Animals.
Bio-101: e1010985. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010985.
