Cryopreservation and Resuscitation of Sperm   

材料与试剂

1. 冷冻麦管（IMV，catalog number: 005565）
2. 移液枪及枪头 （Eppendorf）
3. 1.5 ml 离心管（AXYGEN，catalog number：MCT-150-C-S）
4. 15 ml 离心管（Corning，catalog number：430791）
5. 3.5 cm 培养皿（CORNING，catalog number: 430165）
6. 一次性使用无菌注射器带针（KDL 1ml）
7. 镊子（吉尔泰）
8. 液氮
9. 矿物油（Sigma，catalog number：M8410）
10. 精子冷冻保护液（Irvine Scientific，catalog number：90128）
11. TH3液（见溶液配方）
12. T3液（见溶液配方）
    

仪器设备

1. 恒温试管架（Cook）
2. 培养箱（Thermo Scientific， model：Forma 3111、Forma 371）
3. 冰箱（海信）
4. 水浴锅（bluepard）
5. 离心机 （Eppendorfcentrifuge，model：5702）
   

实验步骤

一、精子冷冻

1. 解冻精子冷冻保护液，放培养箱37 °C加热 30 min，摇匀精子冷冻保护液；
2. 将TH3放于37 °C恒温试管架上预热 30 min；
3. 提前在精子冷冻麦管上标注好具体信息；
4. 将采集的精子放于37 °C恒温试管架上液化15-20 min；
5. 将液化好的精子用移液枪吸入1.5 ml 的离心管中，根据精子的液化浓度加入适量的TH3液，即精子液化量与TH3液的总量是三的倍数；
6. 按照冷冻保护液：精液等于1:3的比例，用移液枪在离心管内加入冷冻保护液，加冷冻液时应一滴一滴慢慢加，加入一滴就轻摇一下，冷冻液加完后，用移液枪轻轻吹打；
7. 用注射器连接上提前标记好的冷冻麦管，先吸一段40 μl的TH3液，再吸一段空气，然后吸80 μl的精子，再吸一段空气，然后再吸40 μl的TH3，最后分别将麦管两头在酒精灯上烧软化后捏紧封口；(见图1）
   
   
   图1. 精液吸入冷冻麦管后将两头封口
   
   
8. 先放入4 °C的冰箱内1 h，然后再将麦管放于距液氮面2 cm的液氮蒸汽上30 min，最后放入精子冷冻液氮罐内；
9. 做好详细记录。

二、精子复苏

1. 提前半小时打开37 °C水浴锅让水温升至37 °C；
2. 提前半小时将TH3和T3放于37 °C恒温试管架上预热；
3. 用镊子从液氮中取出冷冻麦管，在空气中停留10 s，然后放37 °C的水浴锅中 1 min；
4. 加入1 ml TH3液体在 15 ml的离心管内，将精子冷冻麦管两头剪开，用注射器将精子推至TH3液体中，静置 10 min；
5. 再加入4 ml TH3 液体在精子离心管内，静置10 min；
6. 将精子1,800 rpm，离心5 min，去上清，加入5 ml的T3液体；
7. 再将精子1,800 rpm，离心5 min，去上清，加入1 ml的T3液体；
8. 再次1,800 rpm，离心5 min，离心后等待精子上游；
9. 上游后取中层的精子，在培养皿内制备精子滴，盖上矿物油，放入培养箱待用。

溶液配方

1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3)（表1）
   
   表1. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium with HEPES (TH3) 配制表
   

   成分	/100ml	/50ml	备注
   NaCl	3.329 ml	1.665 ml	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	119.5 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	147 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	51 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	24 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	105.3 mg
   HEPES	240 mg	120 mg
   D-Glucose	90 mg	45 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	6 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	85 μl
   BSA	300 mg	150 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	500 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	5 μl
   pH	7.4

2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3)（表2）
   
   表2. Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate medium without HEPES (T3) 配制表
   

   成分	/100ml	/10ml	备注
   NaCl	3.329 ml	333 μl	200 mg/ml stock
   KCl	239 μl	23.9 μl	100 mg/ml stock
   CaCl2·2H2O	294 μl	29.4 μl	100 mg/ml stock
   MgCl2·6H2O	102 μl	10.2 μl	100 mg/ml stock
   NaH2PO4	48 μl	4.8 μl	100 mg/ml stock
   NaHCO3	210.6 mg	21.06 mg
   Glcose	90 mg	9 mg
   Sodium Pyruvate	12 mg	1.2 mg
   Sodium lactate (60% syrup)	0.17 ml	17 μl
   BSA	300 mg	30 mg
   penicillin-streptomycin (100X)	1 ml	100 μl
   Phenol Red (0.01%)	10 μl	1 μl
   pH	7.4

参考文献

1. 胡京美，许成岩，李媛，耿玲，马刚，王丽，陈子江. 冷冻保护剂与精液比例对冷冻复苏后精子活力的影响. 中华男科学杂志，2009年5期
2. 朱文兵，范立青，卢光琇. 不同配比的保护剂对人类精子冷冻复苏后活动能力的影响. 中国现代医学杂志，2005年6月第15卷第11期