Pig In Vitro Fertilization   

材料与试剂

1. 四孔板（NUNC）
2. 培养皿（NUNC）
3. 2.5×2.0mm玻璃管（WPI）
4. BSA（Sigma，catalog number: A8022）
5. NaHCO₃（Sigma，catalog number: S-8875）
6. Na-Pyruvate（Sigma，catalog number: 4562）
7. HEPES (Na-Salt)（Sigma，catalog number: H3784）
8. HEPES (Acid) （Sigma，catalog number: H4034）
9. L-Glutamine（Sigma，catalog number: G-7029）
10. TCM 199 [10x] （Sigma，catalog number: M0650）
11. H₂O（Sigma，catalog number: W1503）.
12. NaCl（Sigma，catalog number: S-5886）
13. KCl（Sigma，catalog number: P-4504）
14. NaH₂PO₄（Sigma，catalog number: S-5011）
15. MgSO₄（Sigma，catalog number: M-2343）
16. CaCl₂·2H₂O（Sigma，catalog number: C-7902）
17. Na Lactate（Sigma，catalog number: L7900）
18. Caffein (Sigma，catalog number: C-0750)
19. KH₂PO₄（Sigma，catalog number: P-5655）
20. MgSO₄·7H₂O（Sigma，catalog number: M-1880）
21. Ca.(Lactate)₂·5H₂O（Fisher，catalog number: C110-500）
22. Hypotaurine（Sigma，catalog number: H-1384）
23. NEAA（Sigma，catalog number: M7145）
24. EAA（Sigma，catalog number: B-6766）
25. Gentamicin（Gibco，catalog number: 15710-064）
26. 75% 酒精（安徽安特生物化学有限公司） 
27. DPBS (Gibco D8537) 
28. 0.9% 生理盐水（衡阳制药有限公司）
29. 石蜡油（Sigma，catalog number: M5310）
    

仪器设备

1. 培养箱（THERMO-3111）
2. 超净工作台（瑞智净化）
3. 体式显微镜（NIKON-SMZ645）
4. 显微镜加热台（THERMO）
5. 移液枪（EPPENDORF）
   

实验步骤

1. 轻轻混合新鲜精子。
2. 用70%乙醇消毒装精子的袋子和剪刀，用纸巾擦干后，在袋子一端剪开一个小口。
3. 将精子移入离心管中。
4. 1100 rpm（300 G）离心10分钟。
5. 去除上清液并添加2ml猪精子洗涤液。
6. 用移液器轻轻重悬精子。
7. 1100 rpm（300 G）离心10分钟。
8. 重复5-7次。
9. 去除上清，并添加2 ml 猪HEPES洗涤液，重悬精子。
10. 1100 rpm（300 G）离心10分钟。
11. 去除上清，并添加猪HEPES洗涤液至500 µl。
12. 用血细胞计数板对精子进行精确计数。
13. 调整精子密度为40000精子/300 µl.
14. 将装有精子的离心管45度角放置于培养箱中2小时。
15. 体内或者体外成熟的猪卵母细胞，用透明质酸酶消化去掉周围的卵丘细胞。
16. 将去卵丘的卵母细胞转移到猪受精液中洗涤3次。
17. 将洗涤好的卵母细胞和稀释好的15µl精子转移到平衡好的受精液中，轻轻混合，每孔卵母细胞不超过80枚。
18. 将精子和卵母细胞在培养箱中共孵育4-6小时。
19. 将受精的卵母细胞在胚胎培养液中洗涤三遍后转移入胚胎培养液PZM-3，于培养箱中（5%CO2、饱和湿度、38.5℃）继续培养。
20. 受精卵培养48小时后观察卵裂率，7天检查囊胚率。
    

结果与分析

受精卵培养48小时卵裂率为80%左右，7天囊胚率为20%左右

失败经验

体外受精容易形成多精受精，需要控制精卵比例。

溶液配方

1. 猪精子洗涤液
   1 mg/ml BSA
   0.9% NaCl
2. 猪HEPES洗涤液
   0.084 g NaHCO₃
   0.11 g Na-Pyruvate
   2.0824 g HEPES (Na-Salt)
   1.0724 g HEPES (Acid)
   0.073 gh L-Glutamine
   50 ml Medium 199 [10x]
   450 ml H₂O
3. 猪受精液
   2.63 g NaCl
   448 mg KCl
   30 mg NaH₂PO₄
   1.05 g NaHCO₃
   301 mg MgSO₄
   1.192 g HEPES-acid
   0.011 g Na-Pyruvat
   0.05 g CaCl₂, 2H₂O
   570 µl Na Lactate
   25 mg Gentamicin
   0.0121 g Caffein
   1.5 g BSA
   494.3 ml H₂O 
4. 胚胎培养液PZM-3
   108.00 mM NaCl
   10 mM KCl
   0.35 mM KH₂PO₄
   0.40 mM MgSO₄·7H₂O
   25.07 mM NaHCO₃
   0.2 mM Na-Pyruvate
   2.0 mM Ca.(Lactate)₂·5H₂O
   1.0 mM L-Glutamine
   5.0 mM Hypotaurine
   10 ml/L NEAA
   20 mg/mL EAA
   0.05 mg/mL Gentamicin
   3 mg/ml BSA
   

致谢

1. 感谢国家重点研发计划“干细胞与转化研究”专项提供经费支持。

参考文献

1. 吕明. (2013). 甲基-β-环化糊精对猪体外受精的影响研究.东北农业大学硕士毕业论文
2. 卢晟盛.（2014）. 影响猪体外受精因素的研究. 广西大学博士毕业论文