摘要:许多RNA通过与特定的蛋白相互结合,引起蛋白的电荷改变、空间结构变化 等进而影响蛋白的功能来发挥作用 (Kligun and Mandel-Gutfreund, 2015),所以,找到RNA特异结合蛋白是了解RNA功能的重要途径。RNA pull down技术是一种常用的寻找RNA结合蛋白的实验技术 (Guo et al., 2020)。该实验方法利用体外合成的带有标记的RNA与细胞裂解液孵育,使体外合成RNA与其靶蛋白结合,进一步通过能与标记RNA结合的磁珠富集RNA,便可同时获得与该RNA结合的蛋白。之后通过质谱鉴定或Western Blot等方法,我们就可以确定该RNA的结合蛋白 (Marin-Bejar and Huarte, 2015)。在目前所有鉴定RNA结合蛋白的技术中,RNA pull down技术具有操作简便、耗时短、花费少等优点,被广泛采用。本文阐述了RNA pull down技术的具体操作步骤以及一些注意事项。
关键词: RNA pull down, RNA结合蛋白, RNA蛋白互作, 生物素标记
研究背景
随着对RNA功能研究的深入,人们发现许多RNA通过结合特定的蛋白质并影响其结构和功能来发挥作用。所以,鉴定RNA结合蛋白能够帮助我们更好地研究RNA的功能。目前,常用的鉴定RNA结合蛋白的方法有RNA pull down、ChIRP (Chromatin Immunoprecipitation by RNA Purification) (Chu et al., 2012)、dChIRP (domain-specific chromatin isolation by RNA purification) (Quinn et al., 2014) 等技术,其中,RNA pull down技术的应用最为广泛。RNA pull down实验首先将体外合成带有生物素标记的RNA与细胞裂解液进行孵育,接着用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的RNA,同时获得RNA-靶蛋白复合体。最后通过质谱或Western Blot等蛋白质鉴定方法,我们就可以确定该RNA的结合蛋白。和其他技术相比,RNA pull down技术操作简单、耗时短、花费少,因此被广泛使用。掌握RNA pull down实验技术,可以帮助我们更好地研究RNA的功能。本文结合本实验室已发表的文章,详细阐述RNA pull down实验的操作过程与结果分析 (Wang et al., 2021)。
材料与试剂
- 移液器枪头 (DNase free,RNase free)
- 1.5 ml EP管
- 100 mm细胞培养皿
- 冰盒
- 200 µl PCR管 (QSP,catalog number: 431-Q)
- 链霉亲和素磁珠 (Pierce,catalog number: 88817)
- T7 RNA Polymerase Riboprobe® Systems (Promega,catalog number: P1440)
- Biotin-16-UTP (Roche,catalog number: 11388908910)
- 生物素 (thermo,catalog number: B20656)
- Tris-HCl (pH = 7.5,thermo,catalog number: 15567027)
- NaCl (国药,catalog number: 10019318)
- SDS (Macklin,catalog number: S817788-500G)
- NP-40 (Macklin,catalog number: N885725-100 ml)
- tRNA (Invitrogen,catalog number: AM7119)
- HEPES (Amresco,catalog number: 0485-25G)
- EDTA (Amresco,catalog number: 0322-1KG)
- Sarkosyl (Macklin,catalog number: D885916-100 ml)
- 脱氧胆酸钠 (国药,catalog number: 69022780)
- DTT (Amresco,catalog number: 0281)
- Protease inhibitor cocktail (Amresco,catalog number: M221-1ML)
- RNasin ribonuclease inhibitor (Promega,catalog number: N2511)
- BSA (Sigma,catalog number: A1470-25G)
- 1x PBS缓冲液 (Hyclone,catalog number: SH30256.01)
- PMSF (碧云天,catalog number: ST506)
- UltraPureTM DNase/RNase-Free Distilled Water,超纯水 (Invitrogen,catalog number: 10977023)
- RNase喷雾清除剂 (Vazyme,catalog number: R504-01)
- LDHA一抗 (Sigma, catalog number: ab14123)
- 5x RIP缓冲液 (见溶液配方)
- 细胞裂解缓冲液 (见溶液配方)
- 生物素洗脱液 (见溶液配方)
仪器设备
- 移液器
- 磁力架
- 水浴锅
- 4 °C冰箱
- -80 °C冰箱
- 恒温金属浴震荡仪
- 4 °C离心机
- Nanodrop分光光度计
实验步骤
一、体外转录带生物素标记的RNA (以已发表文章中LINC00973为例)
- 设计靶向目的RNA LINC00973的PCR引物,以MDA-MB-231-LM2细胞的cDNA为模板,克隆得到RNA LINC00973的全长DNA片段。
- 利用PCR技术在LINC00973 DNA片段起始端添加一段T7启动子片段,然后扩增得到带有T7启动子的LINC00973 DNA片段。 (T7启动子是体外RNA合成酶T7 Polymerase识别和结合的区域。当T7 Polymerase结合到LINC00973前的T7 启动子区,就能启动转录,转录出LINC00973 RNA。)
- 取1个200 µl PCR管,加入0.5 µg带T7启动子的LINC00973 DNA片段模板,配制体外转录体系,如表1所示。
表1. RNA体外转录体系
Transcription Optimized 5x Buffer | 10 µl |
DTT, 100 mM | 5 µl |
Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor | 1.25 µl |
rNTP (rATP+rCTP+rGTP), 100 mM | 7.5 µl |
rUTP, 100 mM | 1.876 µl |
Biotin-16-UTP,100 mM | 0.124 µl |
T7 Polymerase, 80 U/µl | 0.25 µl |
带T7启动子LINC00973 DNA片段模板 | 0.5 µg |
Nuclease free H2O | 加至总体积为50 µl |
- 将配置好的RNA体外转录体系放入PCR仪中,37 °C反应8 h或过夜。
- 反应完成后,用TRIzol法 (Donald et al., 2010) 纯化体外合成的RNA,用Nanodrop分光光度计测量产物浓度。利用RNA分子量计算工具 (如Oligo Calc,http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 获取RNA的分子量,根据分子量我们便可以进一步换算出转录产物的摩尔浓度。如果不能马上进行下面的步骤,要将体外转录RNA放到-80 °C冰箱保存。
二、其他材料准备
- 用100 mm细胞培养皿培养MDA-MB-231-LM2细胞。待细胞铺满约80%培养皿底部时,移除培养基,用PBS洗涤细胞两次,再用5%胰酶消化细胞,用培养基重悬,进行细胞计数。
- 收集约2 x 107个细胞,置于离心机中以100 × g转速离心5 min去除培养基,再用1 ml PBS轻轻重悬细胞,置于离心机中以100 × g转速离心5 min去除培养基。向EP管中的细胞沉淀加入300 μl细胞裂解缓冲液,用移液枪轻轻吹打混匀后,于4 °C,10 rpm条件下在旋转混匀仪上摇晃裂解30 min。最后将样品放至4 °C预冷的离心机中 13,000 × g离心15 min收取上清。
- 取50 µl链霉亲和素磁珠,用1 ml 1x RIP缓冲液洗涤两次,然后用50 µl 1x RIP缓冲液重悬磁珠。
- 将洗涤后的磁珠加入到细胞裂解液中,在4 °C条件下摇晃孵育2 h,然后将装有细胞裂解液的EP管置于磁力架上,待磁珠都被磁铁吸附到一起、管中液体变得澄清后,小心地将上清吸取至新的EP管中,重新加入洗涤后磁珠吸附取上清1次。该步骤的目的是去除细胞裂解液中能够直接结合磁珠的蛋白,避免干扰实验结果。取50 µl细胞裂解液上清液作为Input组保存于-80 °C,剩下的用于接下来的RNA结合实验。
- 体外转录RNA复性:取50 pmol体外转录得到的带有生物素标记的LINC00973 RNA (稀释至终体积约10-50 µl即可) 于 200 µl PCR管中,在65 °C水浴锅中加 热5 min,然后关闭水浴锅,让水温慢慢降至室温 (一般约15-25 min)。随后将装有RNA样品的PCR管低速离心使壁上的冷凝水回到管底,再将样品放置在冰盒上备用。
三、体外转录RNA与蛋白质共同孵育
- 将复性后的RNA加入到250 µl磁珠处理后的细胞裂解液上清中作为实验组,另外可以多设一组阴性对照组,不加RNA到细胞裂解液中。两组样品均加入tRNA使其终浓度为20 µg/ml,在4 °C条件下过夜摇晃孵育。
- 取25 µl链霉亲和素磁珠,用1 ml 1x RIP缓冲液洗涤两次,然后用20 µl 1x RIP缓冲液重悬,加入BSA使其质量百分比浓度为1%,在4 °C条件下,将磁珠置于旋转混匀仪上以10 rpm转速摇晃封闭2 h,然后通过磁力架吸附去除液体。
- 将步骤1孵育好的RNA-细胞裂解液混合物转移到步骤2封闭好的磁珠中,轻轻吹打重悬磁珠,在4 °C条件下将样品置于旋转混匀仪上以10 rpm转速摇晃孵育2 h。阴性对照组也采取同样处理。
- 用5x RIP缓冲液 (需要额外添加蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂:1x Protease inhibitor cocktail,25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor) 对磁珠进行洗涤,洗 涤4次,每次在旋转混匀仪上4 °C、10 rpm摇晃5 min。再用细胞裂解缓冲液洗涤4次,同样每次在旋转混匀仪上4 °C、10 rpm摇晃5 min。
- 向磁珠中加入50 µl生物素洗脱液,放置在恒温金属浴震荡仪上,37 °C、800 rpm条件下反应30 min,然后用磁力架吸附磁珠收集上清。RNA结合的蛋白就在上清液中。
四、Western blot实验验证RNA与蛋白质的相互作用
- 用BCA法测量实验组和阴性对照组的input组的蛋白浓度 (实验组和阴性对照组通过RNA富集的含有靶蛋白上清液组,正常情况下,蛋白浓度极低,无需测量)。
- 将实验组和阴性对照组的input各取10 µg用于western blot实验。实验组和阴性对照组RNA pull down 的含有靶蛋白上清液的上样量按照各自input的体积的1/5 (每组原本250 µl的细胞裂解液用于pull down实验,最后用50 µl生物素洗脱液洗脱,相当于浓缩了5倍,故上清液的上样体积为input的1/5)。用LDHA抗体和用作对照的TXN抗体检测各组样品中的LDHA和TXN蛋白的含量。
结果分析
Western blot的结果如图1所示,实验组 (LINC00973) 和阴性对照组 (mock) 的input中均检测出LDHA和TXN的存在,说明细胞中表达LDHA和TXN。实验组的LINC00973 pull down的上清中可以检测到LDHA蛋白,不能检测到TXN蛋白,而阴性对照组里两种蛋白都不能检测到。这说明我们利用体外合成的RNA LINC00973能够特异性地结合LDHA蛋白,不能结合到TXN蛋白,且阴性对照组的结果排除了磁珠直接结合LDHA蛋白的可能性。所以,我们利用RNA pull down技术,成功证明了在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231-LM2中,RNA LINC00973能够特异性地与LDHA蛋白结合。这为我们研究RNA LINC00973的功能指明了方向。
图1. Western blot实验结果证实LINC00973能够特异性结合LDHA蛋白 (Wang et al., 2021)
注意事项
- 实验操作过程要注意防止RNA的降解,所有实验用品都要保证没有DNase和RNase;实验操作前最好用RNase喷雾清除剂擦拭手套、实验台、移液器、冰盒等需用到的材料和器械。
- 在操作过程中要注意穿戴好干净的口罩、手套、实验服等,避免杂质掉落到裂解液中,导致质谱检测分析中出现大量的角蛋白污染。
- 体外转录获得的RNA由于经过提纯等步骤,部分RNA的结构状态可能发生变化。而RNA与靶蛋白质的相互作用时,很大程度上依赖于RNA的正确的结构状态,所以在进行RNA与蛋白孵育前,须先经过RNA复性这一步。先在65 °C水浴锅中加热5 min,打破碱基的互补配对从而破坏RNA的折叠结构,使得RNA形成单链的状态;关闭水浴锅后,让水温慢慢降至室温,在该过程中,可以让RNA充分折叠恢复正确的结构。
溶液配方
所有溶液配制中用到的水都是超纯水
- 5x RIP缓冲液
125 mM Tris-HCl (pH = 7.5)
500 mM NaCl
2.5% NP-40 - 细胞裂解缓冲液
1x RIP缓冲液 (5x RIP缓冲液稀释5倍)
1 mM DTT
1 mM PMSF
1x Protease inhibitor cocktail
25 U/ml RNasin ribonuclease inhibitor - 生物素洗脱液
100 mM HEPES (pH = 7.5)
500 mM NaCl
1.5 mM EDTA
12.5 mM D-biotin
1% SDS
0.1% Sarkosyl
0.02% sodium deoxycholate
参考文献
- Chu, C., Quinn, J. and Chang, H. Y. (2012). Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP). J Vis Exp (61): 1-6.
- Guo, C. J., Ma, X. K., Xing, Y. H., Zheng, C. C., Xu, Y. F., Shan, L., Zhang, J., Wang, S., Wang, Y., Carmichael, G. G., Yang, L. and Chen, L. L. (2020). Distinct processing of lncRNAs contributes to non-conserved functions in Stem Cells. Cell 181(3): 621-636.
- Kligun, E. and Mandel-Gutfreund, Y. (2015). The role of RNA conformation in RNA-protein recognition. RNA Biol 12(7): 720-727.
- Marin-Bejar, O. and Huarte, M. (2015). RNA pulldown protocol for in vitro detection and identification of RNA-associated proteins. Methods Mol Biol 1206: 87-95.
- Quinn, J. J., Ilik, I. A., Qu, K., Georgiev, P., Chu, C., Akhtar, A. and Chang, H. Y. (2014). Revealing long noncoding RNA architecture and functions using domain-specific chromatin isolation by RNA purification. Nat Biotechnol 32(9): 933-940.
- Wang, H., Lin, K., Zhu, L., Zhang, S., Li, L., Liao, Y., Zhang, B., Yang, M., Liu, X., Li, L., Li, S., Yang, L., Wang, H., Wang, Q., Li, H., Fu, S., Zhang, X., Jiang, P., CliffZhang, Q., Cheng, J. and Wang, D. (2021). Oncogenic lncRNA LINC00973 promotes Warburg effect by enhancing LDHA enzyme activity. Science Bulletin. (in press).
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Q&A
Copyright: © 2022 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:朱林, 王会丽, 王栋. (2022). 利用体外合成带生物素标记的RNA富集细胞裂解液 中与之互作的蛋白的方法.
Bio-101: e1010805. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010805.
How to cite: Zhu, L., Wang, H. L. and Wang, D. (2022). A Method for Purifying RNA Interacting Proteins from Cell Lysates by Using in vitro Synthesized Biotin-labeled RNA.
Bio-101: e1010805. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010805.