mRNA抓取：此步骤主要利用带有T碱基的磁珠进行mRNA的纯化
- 取1000 ng 总RNA样品调整为50 µL，置于冰上备用。
- mRNA抓取磁珠需要以mRNA磁珠结合缓冲液清洗后方可使用。
- 先将96孔板放上磁力架，依样品数量准备mRNA抓取磁珠，每管加入50 µL混匀的mRNA抓取磁珠。
- 磁珠与保存液分开后，移除澄清的液体并加入50 µL mRNA磁珠抓取缓冲液。
- 将96孔板移出磁力架，以枪头吸打混合均匀再放回磁力架。
- 再次移除澄清液体并加入50 µL mRNA磁珠抓取缓冲液。
- 将96孔板移出磁力架，以枪头吸打混合均匀。此时磁珠已具备mRNA抓取能力。
- 将各组总RNA样品(1000 ng in 50 µL)依序放入含有混合均匀磁珠的管中。
- 将96孔板覆上硅胶盖封膜再放入已预热好的PCR仪中，65 °C 2分钟再于20 °C冷却5分钟。
- 当磁珠与目标mRNA片段结合后，将96孔板放上磁力架，当磁珠与磁力架结合后，移除澄清液体。
- 各管加入100 µL的mRNA清洗缓冲液，将96孔板移出磁力架。各管以枪头吸打混匀。
- 将96孔板放上磁力架，当磁珠与磁力架结合后，移除澄清液体。
- 以50 µL无核酸水洗脱各管中的mRNA。
- 进行第二次磁珠的mRNA抓取。
- 第二次抓取采用较高的温度，于70 °C反应2分钟再于20 °C冷却5分钟。
- 在磁珠结合后，于各管中加入50 µL mRNA磁珠抓取缓衝液并以枪头吸打混匀。
- 混合均匀后，放回PCR仪于20 °C反应5分钟。
- 此时磁珠与目标mRNA片段已再度结合后，将96孔板放上磁力架，当磁珠与磁力架结合后，移除澄清液体。
- 各管加入200 µL的mRNA清洗缓衝液，将96孔板移出磁力架。各管以枪头吸打混匀。
- 将96孔板放上磁力架，当磁珠与磁力架结合后，移除澄清液体。
注意: 残留的清洗缓冲液会影响后续cDNA的合成，务必将所有液体彻底移除。
mRNA洗脱、酶系打断、接上随机引物：洗脱后的mRNA将会被酶切割为300 bp的小片段并连接上引物
- 由于磁珠过度干燥会造成文库制备产量大幅下降。在mRNA抓取最后一步移除澄清液体前，要先将此步骤的体系(步骤2)混合备用。
- 洗脱、酶系打断及随机引物已在试剂盒中混合成2×体系，只需要在冰上依比例以无RNase水混合为1×工作浓度。
•11 µL 无RNase水
•11 µL Fragment, Prime and Elute Buffer - 每管加入22 µL的反应液，依据目标片端大小选择反应时间及温度。
- 我们实验中的目标片段大小为201-300 bp，故将反应体系置于PCR仪于94 °C反应6分钟。
- 6分钟后立即将96孔板放上磁力架，切勿置于冰上。 (当样品降温时，带有PolyA尾的RNA会形成杂合物)
- 每一管取出20 µL的澄清液体置于冰板上并立即进行反转录。
合成第一链cDNA：利用随机引物将小片段mRNA反转录为第一链cDNA
- 在冰板上组装cDNA合成所需试剂。
•20 µL 带有随机引物的短片段mRNA (已在96孔板中)
•10 µL 第一链cDNA合成反应液 - 每管加入10 µL 试剂，吸打混匀数次。
- 将96孔板放入PCR仪，25 °C 10分钟使Primer延伸，再于42 °C合成第一链cDNA，最后以70 °C 15分钟使酶失活，4 °C 保持。
合成第二链cDNA：将cDNA和RNA混合的双链转为双链cDNA (dscDNA)
- 在冰板上预制第二链cDNA合成所需试剂：
•30 µL cDNA:RNA混合的双链 (已在96孔板中)
•30 µL 第二链cDNA合成反应液 - 每管加入30 µL 试剂，以枪头吸打混匀数次
- 将96孔板放入PCR仪，16 °C60分钟合成第二链的cDNA，4 °C 保持。
纯化:在此步骤中需要利用1.8X KAPA Pure beads进行纯化。
- 从PCR仪取出96孔板，加入KAPA Pure beads进行纯化：
•60 µL 双链cDNA
•108 µL KAPA Pure beads - 吸打混匀数次，将96孔板置于室温10分钟。
- 将96孔板放上磁力架，待溶液变澄清时移除160 µL上清液。
- 每管加入200 µL 80%乙醇。(需从无磁珠侧的管壁缓慢加入，不可以酒精直接冲洗磁珠)
- 等待30秒后，小心的移除乙醇。
- 重复步骤4和5。
- 等待5分钟，当磁珠表面乙醇蒸发，立刻加上A尾的反应液 (A-tailing)。
加A尾：于双链cDNA的尾端加上A碱基
- 将30 µL 的反应液加上已挥发乙醇的磁珠，吸打混匀。
- 将96孔板放入PCR仪，于30 °C30分钟加上A尾，再以60 °C处理30分钟使酶失活。
接头连接：接头上带有T碱基，利用T-A连接的原理连接接头与双链cDNA
- 立即进行接头连接，接头需依照样品起始量调整浓度。
- 本次试验起始量为1000 ng，故将接头调整为700 nM的母液，实际工作浓度为50 nM。
- 混合接头连接反应液：
•30 µL加A尾的DNA
•35 µL接头连接混合液
•5 µL稀释后的接头母液 (700 nM) - 以枪头吸打混匀，放入PCR仪于20 °C反应15分钟。
连接后纯化：由于未结合cDNA的接头会形成二聚体影响文库质量，此步骤利用1X KAPA Pure Beads移除小片段DNA，共进行两次纯化
- 预制纯化所需试剂
•70 µL带有接头及DNA的磁珠
•70 µL PEG/Na 混合溶液 - 以枪头吸打混匀。
- 置于室温10分钟。
- 将96孔板置于磁力架上。
- 以枪头移除135 µL澄清液体。
- 每管加入200 µL 80%乙醇 (从远离磁珠侧的管壁加入)。
- 等待至少30秒，小心移除乙醇。若有剩馀少量乙醇，可用10 µL枪头吸出。
- 在室温条件下等待乙醇挥发。(约3-5分钟)
- 将96孔板移出磁力架，即刻加入50 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
- 在室温等待2分钟，DNA会溶于Tris缓衝液中。
- 将96孔板放回磁力架。
- 再度重複上述步骤(1-8)，再以22 µL10 mM Tris-HCl (pH 8.0)回溶DNA(室温2分钟)。
- 将6孔板放回磁力架。
- 吸取10 µL澄清液体(注意不可吸入任何磁珠)。
扩增：利用接头上的通用序列以通用引物进行文库扩增，需依照样品量调整扩增循环
- 预制扩增所需反应试剂
•20 µL纯化后带有接头的DNA片段
•30 µL文库扩增试剂混合液 - 放入PCR仪进行扩增
•98 °C 45秒 初始变性 (1次循环)
•98 °C 15秒 变性
•60 °C 30秒 退火
•72 °C 30秒 延伸
(上述三步骤循环数依样品量决定，本次试验为8个循环)
•72 °C 5分钟 最终延伸
•4 °C 保持 - 立刻进行纯化
纯化：此步骤利用1x KAPA Pure Beads再次移除小片段DNA (引物二聚体、接头二聚体…等)
- 预制纯化所需试剂
•50 µL纯化后带有接头的DNA片段
•50 µLKAPA Pure Beads - 以枪头吸打混匀，室温等待10分钟。
- 将96孔板放上磁力架，待溶液澄清，吸去澄清液体。
- 加入200 µL80% 乙醇 (从远离磁珠侧的管壁加入)。
- 等待至少30秒，小心移除乙醇。若有剩余少量乙醇，可用10 µL枪头吸出。
- 在室温条件下等待挥发 (约3-5分钟)。
- 当磁珠块边缘出现裂痕，将96孔板移出磁力架，即刻加入22 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
- 在室温等待2分钟，DNA会溶于Tris缓衝液中。
- 将96孔板放回磁力架，待溶液变为透明。
- 每管取出20 µL澄清清液 (注意不可吸入磁珠) 放入1.5 mL低吸附 EP管中。
- 取出1 µL样品，以Qubit检测文库中DNA浓度。
- 若欲检测文库质量，可使用Bioanalyser配合Agilent DNA 1000 试剂组。此法可确认文库是否符合预期片段大小及接头二聚体是否确实被移除。
- 将样品标记并置于-20 °C冰箱中保存即可以 Illumina测序仪进行文库测序。
实验结果
起始量1000 ng 总RNA，经mRNA 抓取磁珠后进行文库构建后，经8个PCR循环扩增获得目标文库，库检质量合格，其中一个样品文库构建质量结果结果检测示例图见下图3。
图3. 文库检测结果图
用户使用心得
相对Illumina的系统，减少了许多DNA Pure beads的用量(许多步骤可重複使用磁珠)，进而节省总试验经费。