摘要:Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯) 染色法,是一种检测细胞分裂的方法。CFSE能够轻易穿透细胞膜,被细胞内的酯酶除去醋酸酯组分后产生荧光,而未进入细胞的CFSE无荧光 (Quah等,2007)。荧光态的CFSE与细胞内的氨基共价结合,偶联到蛋白上,伴随细胞分裂过程,平均分配到子代细胞中,子代细胞荧光强度减少一半。荧光强度随子代细胞分裂而递减,通过流式细胞技术,能够检测荧光强度递减产生的不同荧光强度的峰,可以监测细胞分裂状态,检测细胞增殖情况 (Fulcher和Wong,1999)。以体外OTII多肽刺激小鼠脾脏细胞为例,用CFSE标记脾脏细胞,添加刺激T细胞的OTII多肽,体外培养脾脏细胞,刺激其中的T细胞使其增殖,流式细胞技术检测T细胞增殖情况。通过选取不同时间节点检测T细胞分裂状态,验证OTII多肽对T细胞增殖的影响。
关键词: CFSE稀释法, T细胞增殖, 流式细胞技术
材料与试剂
仪器设备
实验步骤
结果与分析
多肽OTII刺激后进行流式分析,先通过FSC-A, SSC-A确定脾脏细胞群 (样品脾脏细胞都表达CD45,可不染CD45,其他样品可进行CD45染色,确定淋巴细胞群),再画出T细胞群 (即mouse CD3+ 细胞),选择这群CD3+细胞进行CFSE荧光强度分析 (图1)。
图1. 流式检测T细胞CFSE荧光强度
未被CFSE标记的脾脏细胞样品,选择CD3+细胞群分析CFSE荧光强度,如图2:
图2.未标记T细胞CFSE荧光强度
CFSE标记后的脾脏细胞,选择CD3+细胞群分析,左侧图为加入OTII多肽刺激后的流式图,右侧图为无刺激的流式图,从上至下分别为刺激 (左侧) 或培养 (右侧) 24 h、48 h、72 h、96 h的细胞增殖情况,如图3所示:
图3. 流式检测OTII多肽刺激 (左) 与无刺激 (右) T细胞CFSE荧光强度
OTII刺激脾脏细胞24 h时,未见不同荧光强度的峰,只有单一CFSE高强度峰,此时T细胞还未大量增殖;从第48 h起,开始检测到T细胞分裂,出现三个连续荧光强度的峰;第72 h,在之前的基础上出现一个新的荧光强度低一级的峰 (图3红色箭头所示);第96 h,又一次出现荧光强度低一级的峰 (图3橙色箭头所示),原始CFSE高强度的峰逐渐消失 (图3绿色箭头所示),证明T细胞持续分裂与CFSE标记细胞增殖实验的可行性。 对比未加入OTII刺激的脾脏细胞,并没有连续CFSE递减的峰出现,说明在无抗原肽刺激的情况下,T细胞增殖不明显。
失败经验
溶液配方
致谢
感谢杨选明实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (81671643)、科技部重点研发计划 (2016YFC1303400) 资助。
参考文献
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