Screening and Genetic Analysis of Ethylene-Response Mutants in Etiolated Rice Seedlings   

研究背景

       在拟南芥中，利用分子遗传学和基因组学的方法已经鉴定了乙烯信号通路的关键组分 (Guo and Ecker, 2004)。乙烯在水稻生长，发育和环境适应中发挥了重要作用，包括胚芽鞘和芽的伸长，通气组织的发育和耐淹反应 (Xu等, 2006; Fukao and Bailey-Serres, 2008; Ma等, 2010)。在水稻和拟南芥中，乙烯调节了不同的生物学过程，因此水稻可能具有独特的乙烯信号传导途径 (Yang等, 2015a)。正向遗传学对于充分揭示水稻乙烯信号通路的机制至关重要。因此，有必要建立一种筛选水稻乙烯反应突变体的有效方法。基于拟南芥 “三重反应”的遗传筛选已经得到了广泛的应用 (Johnson and Ecker, 1998; Stepanova and Ecker, 2000)。然而，由于水稻乙烯反应表型的未知性，水稻中的遗传筛选鲜有报道。
       黑暗中，乙烯促进水稻胚芽鞘的伸长生长 (Ku等, 1970)。在我们的实验条件下，乙烯促进水稻胚芽鞘的生长而抑制根的生长，我们称之为“双重反应”。在过去十年中，我们根据“双重反应”已经鉴定了一系列的水稻乙烯反应突变体。我们将其命名为maohuzi(mhz) (Ma等, 2013)。mhz7/OsEIN2突变体的胚芽鞘与根均对乙烯不敏感，而其过表达转基因株系表现为组成型的乙烯反应和过敏感表型 (Ma等, 2013)。MHZ6/OsEIL1与其同源基因OsEIL2分别调控水稻根与胚芽鞘的乙烯反应 (Yang等, 2015b)。MHZ4/OsABA4 (Ma等, 2014) 与MHZ5/OsCRTISO (Yin等, 2015) 的研究发现，在水稻中，乙烯抑制水稻根的生长需要ABA途径，这与拟南芥中是完全不同的。MHZ2/SOR1的研究揭示了SOR1-OsIAA26信号模块位于TIR/ABF2-auxin-OsIAA9信号的下游，特异性地调节水稻根乙烯反应的新机制 (Chen等, 2018)。MHZ3的研究表明，乙烯诱导的MHZ3可以与OsEIN2互作并稳定OsEIN2蛋白，从而维持乙烯反应 (Ma等, 2018)。本文中我们详细描述了水稻乙烯反应突变体的筛选及相关分析方法。该方案也可用于其他单子叶植物的乙烯反应筛选与鉴定 (Yang等, 2015a)。此外，通过该方法我们还鉴定到了具有长中胚轴的突变体gaoyao (gy1)，揭示了乙烯通过促进茉莉酸的合成从而抑制中胚轴和胚芽鞘伸长的机制 (Xiong等, 2017)。

材料与试剂

1. 注射器：2 ml，5 ml和60 ml
2. 培养皿 (康宁Corning, PYREX^®, catalog number: 3160-60)
3. 硅胶塞 (Laboran, catalog numbers: 9-860-03, 9-860-06, 9-860-09, 9-860-11等)
4. 密封塑料盒和杯子：
   
   1)

   5.5 L盒子 (乐扣乐扣, catalog number: HPL836) 与12孔的不锈钢筛子
   2)

   520 ml杯子 (乐扣乐扣, catalog number: HPL931N) 与不锈钢网
   注：盖上盖子以后杯子的容积是520 ml。
   3)

   20 L盒子 (FUDOGIKEN, catalog number: 112025) 与100孔的不锈钢筛子
   注：每个盒子的侧面有一孔，每个孔配有合适型号的硅胶塞；杯子的盖子上也配有合适型号的硅胶塞 (图1)。
5. 植物种子：野生型，突变体或者转基因种子
6. 乙烯气体
7. 1-甲基环丙烯 (1-MCP) (绿诺生物科技, Maxfresh)
   
   
   图1. 密封塑料盒与杯子。 每个容器都配备有合适型号的硅胶塞以便注入乙烯气体。
   

仪器设备

1. 烧杯 (BOMEX, 250 ml或者500 ml, 可根据种子的多少选择合适的烧杯)
2. 弱的绿光光源 (普通的市售绿光灯即可)
3. 不锈钢筛子和不锈钢网：
   
   1)

   12孔筛子(240 mm长 x 180 mm宽 x 33 mm高) 可用于乙烯反应表型分析。
   2)

   直径62 mm的不锈钢网与100孔的筛子(400 mm长 x 300 mm宽 x 33 mm高) 可用于突变体的筛选、阳性苗的筛选以及图位克隆材料的处理与筛选。
   注：每个筛子的四角各有一个高29 mm腿 (图2)。
4. 可以密闭的瓶子：300 ml与1,000 ml的容量
5. 培养箱 (可以设置28 °C与37 °C)
6. 烘箱
7. 喷壶
   
   
   图2. 12孔筛子、100孔筛子与不锈钢网。A. 筛子的侧面图；B. 筛子的俯视图； C. 直径62 mm的不锈钢网。
   

实验步骤

1. 乙烯处理水稻黄化苗
   
   1.1

   种子萌发
   

   1)

   将新收获且已经风干两天的种子放入40 °C的烘箱中处理5~10天，然后再将烘箱调至50 °C处理48小时以打破种子的休眠；
   注：已经破休眠的旧种子可以直接使用，无需此步骤的处理。

   2)

   选择20~60粒饱满成熟的种子均匀平铺在筛子孔或者直径62 mm的不锈钢网上，用于表型分析；
   注：由于机械阻力的存在，太多的种子会影响表型分析。

   3)

   将铺有种子的筛子放入相应的5.5 L或者20 L的盒子中。5.5 L的盒子中加入2 L的自来水或者20 L的盒子中加入5.4 L的自来水以完全浸泡种子。用杯子做表型分析时，可以将种子放置在烧杯中，加入适量的自来水至完全浸没种子。
   注：确保所有的种子完全浸没在水中。漂浮于水面的种子容易被微生物污染。

   4)

   将敞口的盒子或者烧杯放置于37 °C的培养箱中黑暗培养1.5~3天，直到多数种子露白 (胚芽鞘长1.5~3 mm)。每天更换自来水以避免微生物污染。
   1.2

   乙烯处理 
   

   1)

   撤掉用于催芽的自来水，加700 ml的自来水至5.5 L的盒子中或者1.9 L的自来水至20 L的盒子中，确保已经萌发的种子距离水面15~16 mm。加80 ml含有或者不含有相应化学试剂的自来水至前面装有已萌发种子的杯子中，确保已经萌发的种子距离水面15~16 mm。然后盖上盒子或者杯子的盖子以密闭培养 (图3)。
   注：确保萌发的种子距离下层的水面15~16 mm目的是保持种子周围空气的湿度，同时确保根，尤其是根尖完全暴露在乙烯或者空气中。
   
   
   图3. 用于表型分析的实验装置。A. 放置于筛子中的萌发种子的俯视图；B. 装有铺着已萌发种子的筛子的5.5 L盒子的侧面图 (为了获得清晰的图片，这些照片是在日光灯下拍摄的，但是在处理时需要在暗的绿光灯下进行，然后黑暗培养)。 
   
   

   2)

   使用合适的注射器将相应量的乙烯气体注入盒子中。对于空气对照，每天开盒子一次以减少内源乙烯的影响。
   注：为了降低内源性乙烯气体的影响，可以使用高氯酸汞或者活性炭。

   3)

   按照以下步骤获得不同浓度的乙烯气体：
   

   1. 首先，用60 ml注射器从密封的300 ml瓶中取出30 ml空气，然后将30 ml乙烯气体注入到300 ml的密封瓶中，即得到10倍稀释的乙烯。然后用5 ml的注射器将3 ml 10倍稀释的乙烯气体注入300 ml的密封瓶中，得到1,000倍稀释的乙烯。
   2. 第二步，用5 ml注射器将3 ml乙烯气体注入300 ml的密封瓶中，得到100倍稀释的乙烯，然后用5 ml的注射器将3 ml 100倍稀释的乙烯气体注入300 ml的密封瓶中，即得到10,000倍稀释的乙烯气体。根据实验设计的需要，将相应稀释倍数的乙烯注入相应体积的密封盒或杯中。例如，对于1 ppm (1 μl/L) 的乙烯处理，用5 ml注射器将4.8 ml 1,000倍稀释的乙烯注入5.5 L盒中，将4.4 ml 1,000倍稀释的乙烯气体注入520 ml杯中，用2 ml注射器将1.9 ml 100倍稀释的乙烯气体加入20 L盒中。

   注：可以使用更严格的处理方式即持续流动的乙烯气体 (Chen and Bl-eecker, 1995)。
   

   4)

   将萌发的种子在28 °C的培养箱中黑暗培养2天；

   5)

   撤掉之前的自来水，加500 ml的自来水至5.5 L的盒子中，加1,000 ml的自来水至20 L的盒子中或者加65 ml的含有或者不含相应化学试剂的自来水至杯子中，确保种子在水面上方19~20 mm处。
   注：目的是通过减少盒子或者杯子中液体的含量确保根悬浮在空气或者乙烯中。

   6)

   然后盖上盖子，按照步骤1.2 (3) 注入适量的乙烯气体，并将幼苗在28 °C的培养箱中黑暗培养1~2天；
   注：将幼苗再培养1~2天即是筛选突变体的最好时机。

   7)

   为了确保水稻幼苗的根或芽/胚芽鞘能持续接触到乙烯和其他化学试剂如ABA或者抑制剂，萌发的种子必须持续接触水面。将含有或者不含有化学试剂的1.5 L液体加入5.5 L盒子中，或者120 ml加入杯子中，使水面接触萌发的种子。然后如步骤1.2 (3) 注入适量的乙烯进行处理。其余步骤同上。
   注：这种改进的方法非常适用于适用较昂贵的化学试剂与乙烯同时处理萌发的水稻种子或者幼苗。当使用杯子时，只需在不锈钢网上放置20~25粒种子以减少内源乙烯的影响。
   1.3

   表型分析
   乙烯促进水稻黄化苗胚芽鞘的伸长，但抑制其根的生长。因此可以根据主根、不定根或胚芽鞘的形态来筛选乙烯反应突变体 (图4)。通过测量不同浓度下水稻黄化苗的主根和/或胚芽鞘的长度来评估不同突变体的乙烯反应强弱。
   
   
   图4. 水稻黄化苗乙烯反应突变体的表型分析案例。A. 筛子中水稻野生型和乙烯反应突变体mhz7-1/Osein2-1的表型比较。乙烯抑制野生型不定根的生长(红色圈)，但mhz7-1/Osein2-1不定根的生长不受其抑制(黄色圈)。B和C. 野生型和mhz7-1/Osein2-1幼苗的乙烯反应表型比较。B是根悬浮在空气或者乙烯中的表型，C是根浸没在水中同时用乙烯处理的表型。
   
   
2. 1-MCP处理
   1-MCP的结构与乙烯类似，是一种广泛应用的竞争性异抑制剂。它可以与乙烯受体不可逆的紧密结合而阻断乙烯感知和乙烯信号转导途径。
   
   2.1

   种子萌发步骤实验步骤1.1所述；
   2.2

   种子萌发后，撤掉之前的自来水。然后加700 ml的自来水至5.5 L的盒子中；
   2.3

   不锈钢筛子上放置装有适量1-MCP粉末的培养皿，然后加入适量的水使1-MCP的终浓度为5 ppm。例如，将1.555 mg的1-MCP粉末 (根据供应商提供的使用说明计算1-MCP的使用量) 溶解在2 ml水中即得到终浓度为5 ppm的1-MCP气体。立即盖上盖子以密闭盒子；
   2.4

   将萌发的种子在28 °C的培养箱中黑暗培养3~4天；
   2.5

   观察表型或者进行基因表达的分析。
3. 乙烯处理分析相关基因的表达谱
   
   3.1

   种子萌发步骤实验步骤1.1所述；
   3.2

   种子萌发后，撤掉之前的自来水，然后加适量水至水面接触到种子 (图5A)；
   3.3

   先将盒子密闭培养24小时左右，再将盒子敞口放置于28 °C的培养箱中黑暗培养1~1.5天；
   注：盒子需敞口放置以减少内源性乙烯的影响。
   3.4

   撤掉之前的自来水。为保持盒子中空气的湿润，添加适量的自来水覆盖盒子底部即可。将筛子调整至更高的位置以确保根部完全悬浮于空气或者乙烯气体中。盖上盖子(图5B与5C)；
   注：用喷壶向盒内的种子和/或幼苗、盒子的内侧壁和盖子喷洒足量的水以保持盒内的湿度，避免干旱胁迫的影响。
   3.5

   根据实验设计，用注射器注入适量的乙烯气体，同时设置相应的对照处理；
   注：对于乙烯响应基因的表达谱分析，每个时间点都需要设置相应的对照。
   3.6

   根据实验设计，在28 °C的培养箱中黑暗培养相应的时长；
   3.7

   采集处理完毕的水稻胚芽鞘、地上部分及根等不同的组织。然后分离RNA并分析相应基因的表达谱。
   注：为了减少伤乙烯的影响，所采集样品应立即在液氮中冷冻保存。
   
   
   图5. 乙烯处理水稻幼苗以分析相应基因的表达谱。A. 侧面图，水刚好浸没发芽种子，用于刚萌发种子的培养；B. 5.5 L盒子的俯视图，不锈钢筛子上有2~2.5天的幼苗；C. 乙烯处理的5.5 L盒子的侧面图 (为了得到清晰的照片，所有照片均拍摄于日光灯下，但整个处理及采样过程需在暗的绿光等下操作)。

数据分析

为了定量分析每个突变体独特的乙烯反应，均需三次生物学重复。可以在不同浓度梯度下测量水稻黄化苗胚芽鞘、主根的长度，然后进行统计分析，例如0, 0.1, 1, 10, 100 ppm。胚芽鞘或根的相对长度可以较好地反映突变体的乙烯反应强弱。计算方法请参考Plant Cell中的图3 (Yin等, 2015)。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金 (31600980, 31530004, 31670274) 的支持。相关的实验方法改编自我们已经发表的相关文章 (Ma等, 2013; Ma等, 2014; Yin等, 2015; Ma等, 2018; Chen等, 2018)。

参考文献

1. Chen, Q. G. and Bleecker, A. B. (1995). Analysis of ethylene signal-transduction kinetics associated with seedling-growth response and chitinase induction in wild-type and mutant Arabidopsis. Plant Physiol 108: 597-607.
2. Chen, H., Ma, B., Zhou, Y., He, S. J., Tang, S. Y., Lu, X., Xie, Q., Chen, S. Y. and Zhang, J. S. (2018). E3 ubiquitin ligase SOR1 regulates ethylene response in rice root by modulating stability of Aux/IAA protein. Proc Natl Acad Sci U S A 115: 4513-4518.
3. Fukao, T. and Bailey-Serres, J. (2008). Ethylene-a key regulator of submergence responses in rice. Plant Sci 175: 43-51.
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5. Johnson, P. R. and Ecker, J. R. (1998). The ethylene gas signal transduction pathway: a molecular perspective. Annu Rev Genet 32: 227-254.
6. Ku, H. S., Suge, H., Rappaport, L. and Pratt, H. K. (1970). Stimulation of rice coleoptile growth by ethylene. Planta 90: 333-339.
7. Ma, B., Chen, S. Y. and Zhang, J. S. (2010). Ethylene signaling in rice. Chin Sci Bull 55: 2204-2210.
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16. Yin, C. C., Ma, B., Collinge, D. P., Pogson, B. J., He, S. J., Xiong, Q., Duan, K. X., Chen, H., Yang, C., Lu, X., Wang, Y. Q., Zhang, W. K., Chu, C. C., Sun, X. H., Fang, S., Chu, J. F., Lu, T. G., Chen, S. Y. and Zhang, J. S. (2015). Ethylene responses in rice roots and coleoptiles are differentially regulated by a carotenoid isomerase-mediated abscisic acid pathway. Plant Cell 27: 1061-1081.