摘要:天然免疫是宿主抵抗病原侵染的第一条防线。解析天然免疫的调控机制对于维持机体的生理健康和了解“宿主—病原”的共进化具有重要的研究意义。果蝇已被广泛证明是研究天然免疫的理想模式动物,源于其天然免疫体系完备,信号通路同高等动物高度保守 (Lemaitre和Hoffmann,2007;Vallet-Gely等,2008),且具有其他模式生物无法比拟的遗传操作优势。在这里,我们详细介绍一种构建果蝇感染模型的经典方式,即体表穿刺感染模型。穿刺损伤果蝇外骨骼将致病菌直接引入果蝇体腔,从而引发机体的系统性免疫应答。该模型也可以很好的模拟高等动物所面临的败血症感染。我们将在此介绍感染后生存率,病原菌增殖,天然免疫通路应答等评价该模型体系的经典指标。
关键词: 天然免疫, 果蝇, 穿刺感染
材料与试剂
- 培养管
- 钨丝
- 铁制回形针
- 96孔板
- 0.5 mm瓷珠
- 果蝇板
- 培养板
- 接种杆
- 酒精灯
- 羽化一周龄果蝇
- 致病菌 (表1)
表1. 本实验室常用穿刺感染致病菌及浓度
*Erwinia carotovora carotovora 15 (Ecc15) 来自于Dr.Won-jae Lee实验室 (Seoul National University);Listeria monocytogenes (10403S) 和S. typhimurium (SR-11) 均来自于刘志华实验室 (Institute of Biophysics, CAS);Pseudomonas aeruginosa (PAO1) 来自于韩家淮实验室 (School of Life Sciences, Xiamen University); Micrococcus luteus (CIP A270) 来自于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。
- 果蝇食物
- 培养基 (LB和BHI培养基)
- 抗菌肽引物
- 70%商品化医用酒精
- 无菌二次水 (DDW)
- CO2
- NaCl
- KCl
- Na2HPO4
- KH2PO4
- 5 M KOH水溶液
- TritonTM X-100
- TRIzol试剂 (ThermoFisher Scientific, InvitrogenTM TRIzolTM, catalog number: 15596026)
- mRNA反转录试剂盒 (abm, 5× All-In-One RT MasterMix, catalog number: G486)
- SYBGreen RT-PCR染料 (abm, 2× qPCR MasterMix, MasterMix-EL 4× 1.25 ml)
- 1× PBS磷酸缓冲液 (见溶液配方)
- 1× PBST (见溶液配方)
仪器设备
- 显微镜
- 高压灭菌锅
- -80 °C冰箱
- 4 °C冰箱
- 离心机
- 涡旋仪 (Vortex)
- 适配1.5 ml EP管的研磨震荡仪 (法国Bertin,Minilys)
- 简易电解装置
- 荧光定量PCR仪 (Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪)
- 细菌培养箱(北京陆希科技有限公司,model: DHP9502A)
- 果蝇恒温恒湿培养箱 (宁波江南仪器厂,HWS智能型;Percival公司,果蝇培养箱)
软件
- GraphPad prism
实验步骤
一、收集和准备实验用果蝇
- 果蝇饲养在恒温 (依据实验条件),恒湿 (60%左右) 和12小时光照–12小时黑暗循环的培养箱中 (Greenspan,2004)。
- 收集三天内新羽化果蝇,保证年龄接近,每小管食物随机分配15~25只果蝇,每两天换一次新鲜食物。再饲养3至4天,待年龄到一周可进行感染实验。每个品系每次感染,应至少准备60只果蝇。
注:
二、培养和准备感染用细菌
- 感染前一到两天取出-80 °C冻存的菌液,划线涂板,在特定温度的培养箱中培养。长有单克隆的培养板可放置于4 °C冰箱,可供一周内感染实验使用。
- 从培养板中挑取单克隆菌落,接种于含3~5 ml培养基的培养管中,置于特定温度的培养箱中培养 (静置或摇振取决于目的菌培养条件)。菌液生长至OD600值介于0.6~0.8时停止培养 (通常3 h培养即可),而后离心浓缩菌体 (一般采用转速6,500 × g (rcf),离心时间3 min)。无菌1× PBS缓冲液清洗菌体两遍,最后用无菌1× PBS稀释菌体到特定的OD600值。本实验室常用致病菌种类及穿刺感染浓度见表1。另外也可参考文献选择其它致病菌及浓度 (Neyen等,2014)。
三、感染用穿刺针的制备
- 建议采用钨丝制备感染针,钨丝耐高温,耐化学腐蚀,硬度较硬,可长期反复使用。用剪刀截取一段长度约3 cm,直径约0.5 mm的钨丝,将钨丝缕直。组装简易电蚀装置制备钨丝针:将一个铁制回形针弯折成一端成半封闭圆环,一端垂直环平面的提勺状工具;电蚀装置的负极电钳夹住回形针竖直一端,正极电钳夹住钨丝针一端;负极末端半环水平浸没在5 M KOH水溶液中,接通电源,正极钨丝另一端垂直浸没在铁环液面中间,开始电解;控制钨针端部浸没的深度和电解时长,每电解2 s取出钨丝针在显微镜下观察钨丝尖电解程度,直至获得尖部直径约在0.2 mm的钨丝针,每根钨丝针的制备大概需要2到3分钟 (如图1A-1D)。电解方法也可参考姚琲等人 (2003)。
图1. 穿刺用钨丝针的制备. A. 5 M氢氧化钾电解液,接种杆,用回形针弯折而成的提勺状半圆形电解环。B. 直流电简易电解装置,正极连接截断的钨丝 (约3厘米),负极连接电解环。C. 在50毫升离心管盖中完成电解,电解环浸没于电解液中,钨丝上下垂直频繁浸没电解液,期间在显微镜下观察钨丝尖部尺寸是否满足穿刺需求 (尖部直径约0.22毫米),继而停止电解。D. 制备好的钨丝针固定在接种杆,以备穿刺。
四、穿刺感染
- 提前准备好穿刺用钨丝针,钨丝针固定到接种杆上,用70%酒精擦洗钨丝针,酒精挥发后置于酒精灯外焰上灼烧5 s至红色,冷却后可重复上述擦洗—灼烧步骤一到两次,保证钨丝针洁净,避免针尖携带的抗原对感染造成影响。
- 实验用果蝇在通二氧化碳的果蝇板上麻醉,在显微镜下用毛刷摆正果蝇位置,即侧面向上 (如图2A-2C)。
- 浓缩后菌液在Vortex上充分混匀,针尖蘸取菌液,在果蝇背部前胸旁侧位置穿刺,针尖需在伤口处停留约2秒钟。由于果蝇体腔处于负压状态,扎破的伤口处菌液会被自动吸入到血液中。同时对照组果蝇应用洁净的钨丝针蘸取无菌1× PBS穿刺。
- 感染后果蝇分装到新的小管中,每管15~25只,每个品系果蝇每次感染至少两管重复,需至少三次重复感染。将果蝇置于特定温度的培养箱中 (多为29 °C),用于记录死亡率,检测菌载量,和检测天然免疫通路的应答,如下游效应因子抗菌肽 (AMP) 的表达。
注:
五、感染后生存率统计
感染后的果蝇应该每一天/两天转移到新的小管中。对于致死能力比较低的细菌,可每一到两天记录死亡只数。对于致死能力强的细菌,可每小时到半天记录死亡只数。记录到所需天数后,采用GraphPad prism画生存率曲线。
注:针刺半小时内死亡的果蝇,不计入生存率统计。有可能是是针扎不当,造成的快速死亡。
六、感染后果蝇RNA提取、cDNA反转录及Q-PCR检测
- 在感染后特定时间点,多检测特定的抗菌肽转录水平以评价天然免疫通路应答。对于IMD通路,可选择感染后0 h,6 h,12 h,和24小时时间点检测激活水平。对于Toll通路,多选择感染后0 h,12 h,24 h,和48 h时间点检测。每次实验每个时间点随机取5只果蝇放入1.5 ml EP管中,至少两个重复,加入冰上预冷的200 μl TRIzol试剂,外加3倍果蝇体积的瓷株 (0.5 mm)。置于小型研磨仪 (Minilys,最大转速,1 min) 充分研磨,研磨后再补加800 μl TRIzol至1 ml,上下颠倒混匀后立刻冻存于-80 °C,以备RNA提取。
- 基于TRIzol的RNA提取方法参考文献 (参考文献9),或选择试剂盒提取RNA。
- 可选取2 μg RNA作为模板,总体积20 μl体系进行逆转录反应,获得的cDNA产物再补加180 μl无菌水进一步稀释,用于模板做后续RT-PCR检测。
- 对于96孔板,取2 μl cDNA稀释液作为模板,检测抗菌肽相对转录水平,所使用引物见表2。
注:一般IMD通路报告基因Diptericin在系统感染革兰氏阴性菌6小时后,转录水平达到最高水平。Toll通路的报告基因Drosomycin则在革兰氏阳性菌系统感染后约30 h转录水平到达最高水平。
表2. 常用抗菌肽RT-PCR引物及序列
七、菌载量涂板检测 (CFUs)
- 对于每个时间点,随机选取5只果蝇放入1.5 ml EP管中,冰上放置。加入1 ml 预冷70%酒精,Vortex震荡10 s,清洗果蝇表面残留的细菌,重复两次,此过程需快速操作,避免酒精对体腔内细菌杀伤。再用1 ml无菌水或1× PBS清洗两次,每次Vortex震荡10 s,洗去残留的酒精。清洗完毕,尽可能吸除EP管中残留的水或PBS。
- 每管加入200 μl 无菌1× PBS,加三倍于果蝇体积的瓷珠 (0.5 mm),充分研磨匀浆。补加800 μl 1× PBS至1 ml,10倍梯度稀释,取100~200 μl稀释液涂板。培养板放置于相应温度的培养箱过夜静置,第二天计数克隆数。在合适稀释倍数下,10 cm平板上生长的克隆,其数目应在300~800之间。
注:
结果与分析
一、生存率 (survival rate) 曲线绘制
利用公式:[100 × (总感染果蝇只数 − 各时间点累积死亡只数)/总感染果蝇只数] % = 生存率 (%),计算每个时间点生存率百分比,采用Graphpad软件绘制生存率曲线。对于每组数据含多条重复曲线,具体按如下步骤绘图:Grouped > Enter/Import data (Enter 3 replicates or more) > x轴输入时间点,y轴输入生存率,及组别名称 > 选取Plot summary data类别下的Superimposed symbol with connecting line, Plot mean with SEM > 生成曲线图,采用Multiple t-tests分析对照组和实验组各时间点显著性差异,如图2 (D,E),野生型果蝇W1118感染E. coli或S. typhimurium后生存率变化。对于每组数据只选取一条代表性曲线,按如下步骤绘图:survival >Enter/Import data >x轴输入时间点,y轴输入相应时间点死亡只数 >生成Kaplan-Meier生存率曲线;采用log-rank test方法比较两组曲线的显著性差异。
二、天然免疫应答检测
果蝇有两条主要的天然免疫应答通路,分别是多响应革兰氏阴性菌感染的IMD通路和响应革兰氏阳性菌和真菌感染的Toll通路。而其下游抗菌肽基因的转录表达水平,可用于衡量这两条天然免疫通路的应答活性,如:抗菌肽基因Diptericin、Drosocin、AttacinA、Attacin-D和Cecropin,多针对于IMD通路的应答,而抗菌肽基因Drosomycin、和Defensin多针对于Toll通路的应答。对于IMD pathway,一过性细菌感染初期,抗菌肽基因表达迅速升高,随着体内细菌被逐渐清除,抗菌肽基因表达逐渐降低至本底水平。但对于一些致病菌造成的持续感染过程,抗菌肽基因表达会长时间维持在高水平。如图2F、2G,野生型果蝇W1118在非致死性致病菌E. coli造成的一过性感染和致死性致病菌S. typhimurium造成的持续感染过程中,抗菌肽基因Diptericin转录水平变化。
三、感染后菌载量评价
感染过程中菌载量变化是评价机体免疫效能的一个重要指标,可以衡量宿主清除病原菌,以及病原菌增殖的情况。非致死性致病菌E. coli感染野生型果蝇后,会被机体持续清除,菌载量逐渐降低。而致死性致病菌S. typhimurium可在宿主细胞内持续增殖和传播,菌载量持续升高 (图2H、2I),机体最终死于菌毒血症。
图2. 穿刺感染后经典免疫指标的检测. A图,模式图展示胸和腹部穿刺感染。果蝇侧位摆放,胸部穿刺感染在前胸侧面,此处外壳较脆,钨丝针尖容易刺破。腹部穿刺感染在胸腹节连接处的稍微偏下位置,腹部外壳较柔软,操作相对困难,针尖容易损伤肠道。B、C和D图,对应A图,展示胸和腹部穿刺感染,沾有菌液的针尖穿刺位置在白色虚线圈内。E和F图,E. coli (OD600 = 200) 和S. typhimurium (OD600 = 10) 感染果蝇后生存率曲线,三次重复,error bar以Mean ± SEM显示,Multiple t-test统计各时间点显著性差异。G和H图,感染后不同时间点抗菌肽Diptericin转录水平变化,E. coli属于非致死性致病菌,随着菌逐渐被清除,免疫反应逐渐降低,而S. typhimurium是致死性致病菌,造成持续感染,免疫反应持续维持在最高水平。I和J图,E.coli和S. typhimurium感染后全身菌载量 (CFUs) 变化,Error bar均以Mean ± SEM显示,采用nonparametric t-test方法统计两个样品之间显著性差异。
溶液配方
- 1× PBS磷酸缓冲液1 L
8 g NaCl
0.2 g KCl
1.44 g Na2HPO4
0.24 g KH2PO4
用去离子二次水定容至1 L,用HCl和5 M NaOH调节pH值至7.4,121 °C高压灭菌20分钟 - 1× PBST
1× PBS
0.1% TritonTM X-100
致谢
感谢潘磊实验室全体成员的建议和帮助。该研究受国家自然基金 (31870887,31570897 –潘磊) 和中国科学院青年创新促进会优秀会员 (潘磊) 的资助。
作者贡献声明:王磊完成全部实验和图片采集。王磊,潘磊撰写文章。
参考文献
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- Greenspan, R. J. (2004). Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Lemaitre, B. and Hoffmann, J. (2007). The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol 25: 697-743.
- Neckameyer, W. S. and Argue, K. J. (2013). Comparative approaches to the study of physiology: Drosophila as a physiological tool. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 304(3): R177-188.
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O. and Lemaitre, B. (2014). Methods to study Drosophila immunity. Methods 68(1): 116-128.
- Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M. and Teixeira, L. (2018). Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biol 16(7): e2005710.
- Vallet-Gely, I., Lemaitre, B. and Boccard, F. (2008). Bacterial strategies to overcome insect defences. Nat Rev Microbiol 6(4): 302-313., 302-313.
- TRIZOL RNA isolation Protocol. https://medicine.yale.edu/keck/ycga/microarrays/protocols/TRIZOLRNAIsolation_092107_21453_284_10813_v1.pdf.
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