摘要:主要介绍制备果蝇总RNA的方法,为后面的RNA实验做准备。
关键词: 果蝇, 总RNA, 制备
材料与试剂
- 1.5 ml离心管
- 果蝇
- TRIzolTM Reagent (InvitrogenTM, catalog number: 15596026)
- TURBO DNA-freeTM Kit (InvitrogenTM, catalog number: AM1907)
- 异丙醇
- 乙醇
- DEPC-H2O
仪器设备
- 离心机 (Eppendorf)
- Thermomixer compact (Eppendorf)
实验步骤
注:该实验需要在RNA洁净区操作,RNA易降解,需要使用RNA专用试剂耗材和设备。务必佩戴洁净的手套甚至口罩。
- 取200 μl TRIzol置于1.5 ml离心管中,放在冰上,将麻醉的10只果蝇放入冰上的离心管中,将果蝇碾碎,再加入800 μl TRIzol试剂,颠倒混匀。
- 室温放置10 min,间歇混匀数次。
- 4 °C,12,000 × g离心10 min,去掉果蝇残体,取上清至新管。
- 加入200 μl氯仿,混匀,室温放置5 min。
- 4 °C,12,000 × g离心15 min。
- 取上清 (约500 μl) 到新的RNAase free的离心管中,加入等体积的异丙醇混匀,室温放置10 min。
- 4 °C,12,000 × g离心30 min。
- 弃上清,加入500 μl 70%乙醇,颠倒数次,使RNA漂浮。
- 4 °C,7,500 × g离心5 min。
- 弃乙醇,如果残留的乙醇有挂壁现象,倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出。室温放置直到白色沉淀呈透明装时加入50 μl DEPC-H2O溶解。
- 50 °C,600 rpm金属浴震荡混匀10 min或者时不时轻弹混匀。
- 加入1 μl DNase,5 μl DNase Buffer,37 °C温育30 min。
- 加5 μl DNase inactive reagent,室温放置5 min,间歇混匀2~3次。
- 4 °C,10,000 × g离心1.5 min。
- 转移上清至新的EP管中,测浓度;-80 °C保存。
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