实验原理:Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出来的核酸酶,保持RNA的完整性。酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中< /b>。收集上层水样层后,可以通过异丙醇沉淀来分离RNA。
实验目的:提取柑橘总RNA用于后续RT-PCR、qRT-PCR、基因克隆、cDNA文库构建、Northern blotting等实验。
关键词: 柑橘, RNA, 提取, 检测
材料与试剂
- RNase-free 离心管 (10 ml、1.5 ml、200 μl)
- RNase-free枪头 (5 ml、1 ml、200 μl、20 μl)
- 液氮
- 氯仿
- 异丙醇
- 无水乙醇
- 异硫氰酸胍
- 硫氰酸铵
- 水饱和酚
- NaAc
- 甘油 (丙三醇)
- 8-羟基喹啉
- 正丁醇
- CTAB
- DEPC (焦碳酸二乙酯)
- Tris Base
- HCl
- EDTA-Na2
- NaOH
- Sarcosy
- NaCl
- 冰醋酸
- 3 mol/L NaAc (pH 5.2) (见溶液配方)
- Trizol Buffer (见溶液配方)
- 75%乙醇 (见溶液配方)
- TESAR (见溶液配方)
- Aq/CTAB与Bu/CTAB (见溶液配方)
- 0.2 mol/L NaCl (见溶液配方)
- 3 mol/L NaAc (见溶液配方)
- DEPC水 (见溶液配方)
- 0.5 mol/L EDTA (见溶液配方)
仪器设备
- 研钵
- -20 °C冰箱
- 各种规格的移液器
- 离心机 (配备10 ml、1.5 ml转头,转速大于14,000 x g)
- 振荡涡旋仪
- 量筒 (500 ml、100 ml)
- pH计
- 磁力搅拌器
- 带盖广口瓶 (5 L)
- 蓝盖瓶 (1 L)
- 通风橱
- 电泳槽
- 制胶板
- 凝胶成像仪
实验步骤
- 粗提
- 纯度
- 浓度检测
取1 μl RNA用NanoDrop1000测定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值及RNA浓度。浓度最好控制在3,000以下,否则稀释。高质量的RNA要求:A260/A280 > 1.8,A260/A230 > 2.0,曲线平滑。
- 琼脂糖凝胶电泳检测
根据RNA浓度取700 ng RNA稀释至5 μl后,用1x TAE,1.2%琼脂糖凝胶120 V电泳20 min,凝胶成像仪拍照保存。高质量的RNA呈现三条清晰条带,点样孔干净无污染、泳道无拖带。从点样孔由近到远三条带依次为28S、18S、5S。28S、18S带很亮,5S带较弱,说明RNA完整性较好。
注意事项
- 为了防止RNase降解RNA,提取过程使用的所有试剂耗材都要经过去RNase处理。
- 提取过程中要带口罩、手套,避免讲话,动作迅速,减少样品暴露在空气中的时间。
- 提取的RNA最好分装多管保存,方便后续实验使用,减少反复冻融。
- 琼脂糖凝胶电泳所用的TAE需要用DEPC水配制,电泳槽、制胶板需要4 mol/L NaOH浸泡4 h,以出去RNase,防止电泳过程中RNA降解。
溶液配方
- DEPC水
在通风橱中 (DEPC易挥发,有剧毒,带口罩、手套,做好防护),往配DEPC水专用的5 L带盖广口瓶中倒入5 L双蒸水,加5 ml DEPC (终浓度千分之一),加入磁力搅拌转子,将广口瓶放在磁力搅拌器上,搅拌混匀过夜 (至少8 h)。然后在通风橱中将5 L DEPC水分装到1 L的蓝盖瓶中,121 °C、30 min灭菌后备用 (高温高压可使DEPC分解,失去毒性)。
- 3 mol/L NaAc (pH = 5.2)
24.6 g无水NaAc或40.8 g NaAc·3H2O,加40 ml DEPC水溶解,定容到100 ml。用固体NaOH和冰醋酸调pH至5.2,121 °C、15 min灭菌后备用
- Trizol Buffer
异硫氰酸胍 | 59.08 g
|
硫氰酸铵
| 38.06 g
|
水饱和酚 (下层)
| 190 ml
|
3 mol/L NaAc
| 16.7 ml
|
甘油
| 25 ml
|
8-羟基喹啉 (有异味)
| 0.5 g
|
DEPC水
| 100 ml |
配好后用力振荡 (10 min) 混匀定容至500 ml,4 °C避光保存
- 75%乙醇
375 ml无水乙醇和125 ml DEPC水混匀,-20 °C保存备用
- 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.6)
12.1 g Tris Base溶解于80 ml DEPC水,再加入约6 ml HCl,用DEPC水定容至100 ml,调pH至7.6
- 0.5 mol/L EDTA
18.7 g EDTA二钠加入80 ml DEPC水中,边搅拌边加入固体NaOH,当EDTA二钠和NaOH完全溶解,溶液变清,用DEPC水定容至100 ml,调pH至8.0,121 °C、15 min灭菌后备用
- 10% Sarcosy
10 g Sarcosy溶解于80 ml DEPC水中,定容至100 ml,121 °C、15 min灭菌后备用
- TESAR
1 mol/L Tris-HCl
| 1 ml
|
0.5 mol/L EDTA
| 200 μl
|
10% Sarcosy
| 10 ml
|
加DEPC水定容至100 ml
|
|
- Aq/CTAB和Bu/CTAB
150 ml正丁醇 (Bu) 和150 ml DEPC水充分混合,静置4 h分层后,上层为水饱和Bu,下层为Bu饱和水。吸取100 ml上层水饱和Bu和100 ml下层Bu饱和水都转移到另一RNase-free的250 ml蓝盖瓶中,加入3.68 g CTAB,剧烈振荡,静置分层 (过夜)。上层为Bu/CTAB,下层为Aq/CTAB,分别吸取出来分装到两个100 ml RNase-free的蓝盖瓶中备用
- 0.2 mol/L NaCl
1.17 g NaCl溶解于80 ml DEPC水中,定容至100 ml,121 °C、15 min灭菌后备用
参考文献
- Liu, Y. Z., Liu, Q. and Tao, N. (2006). Efficient isolation of RNA from fruit peel and pulp of ripening navel orange (Citrus sinensis Osbeck). J Huazhong Agric Univ 25(3): 300-304. (in Chinese)
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Q&A
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:徐远涛 , 刘永忠 , 陶能国 , 徐强 , 邓秀新. (2018). 柑橘总RNA提取.
Bio-101: e1010200. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010200.
How to cite: Xu, Y. T., Liu, Y. Z., Tao, N. G., Xu, Q. and Deng, X. X. (2018). Extraction of Total RNA from Citrus.
Bio-101: e1010200. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010200.