实验目的:亚细胞定位,BiFC等需要进行瞬时表达的实验。
关键词: 原生质体, 黄化苗, 酶解
材料与试剂
- 2 ml圆底离心管,10 ml圆底离心管
- 各种型号枪头 (所有与原生质体接触的枪头都要剪去尖头)
- 刀片
- 锡纸
- 培养皿
- 150目的筛子
- 中花11黄化苗
注:将中花11种子按照组培方法于生根培养基中发芽,28 °C暗培养10-15天。少于10天的黄化苗叶鞘很短,细胞太小,不利于观察;而大于15天的黄化苗叶鞘由白色转为略带褐色,细胞太老,原生质体转化后活细胞很少。
- 质粒
注:CsCl梯度离心纯化的质粒,或者QIAGEN plasmid Midi Kit (Catalog number: 12143)纯化的质粒
- KOH
- Cellulose RS (Yakult Honsha)
- Macerozyme (Yakult Honsha)
- PEG4000 (Fluka)
- BSA (Sigma)
- Mannitol (Sigma)
- KCl (Sangon)
- CaCl2 (BBI)
- MgCl2 (Sigma)
- NaCl (BBI)
- MES hydrate (Sigma)
- 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17) (见溶液配方)
- 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55) (见溶液配方)
- 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02) (见溶液配方)
- 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21) (见溶液配方)
- 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44) (见溶液配方)
- 0.1 M MES KOH, pH 5.7 (见溶液配方)
- MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) (见溶液配方)
- 酶解液 (Enzyme solution) (见溶液配方)
- W5 solution (见溶液配方)
- MMG solution (见溶液配方)
- 40% PEG 4000 (见溶液配方)
仪器设备
- 真空泵
- 摇床
- 移液枪
- 可调加减速度的吊篮式冷冻离心机
- 计时器
- Confocal显微镜
实验步骤
- 配制酶解液,现配现用(见溶液配方7),同时准备0.6 M Mannitol (溶液配方1)。
- 将酶解液倒到大小合适干净的培养皿中。将暗培养10-15天的黄化苗取出,将叶鞘浸在0.6 M Mannitol中,用锋利的刀片快速切割叶鞘成1 mm以下的小段,越细越好,不要撕扯。切下的叶鞘立即转入配好的酶解液中。一般50棵黄化苗的叶鞘用10 ml酶解液酶解,可至少转化5个质粒组合。更多的转化可扩大相应反应体系。叶鞘切完毕,泡在酶解液中,抽真空5-10 min,使大部分叶鞘下沉到酶解液底部。将酶解液用锡纸包被以避光,放置在28 °C,40-50 rpm的摇床上,酶解4-5 h。酶解完成后,取一滴酶解液镜检,如果细胞圆而发亮,则健康,继续往下做;如果细胞扁且发黑,则弃去。
- 酶解将近完成时,配制W5 solution及MMG solution (见溶液配方8及9)
- 将酶解液混匀,用150目的筛子过滤到新的培养皿中,再转移至10 ml圆底离心管中。100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min,并预冷MMG溶液。
- 用1 ml移液枪吸走上清,可见到管底有较多黄绿色沉淀,此为健康的细胞;如果沉淀很少,或者沉淀很白,则细胞质量不好。缓缓加入4 ml W5溶液,轻轻混匀,再以100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。
- 用1 ml移液枪吸走上清,缓缓加入4 ml预冷的MMG溶液,以4 °C,100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。
- 用1 ml移液枪吸走上清,缓缓加入2 ml预冷的MMG溶液,轻混匀,以4 °C,100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。计算需要原生质体的体积:200 μl x N,再多留500 μl。用移液枪吸走上清,用所需体积的MMG溶液混匀原生质体,冰浴30 min。
- 在冰浴期间准备:将需要转化的质粒稀释成20 μl,质粒的量为2-10 μg,加到2 ml圆底离心管中。将离心机转头换成2 ml的小转头,温度设定为室温。
- 配制40% PEG4000溶液 (见溶液配方10)。
- 将原生质体混匀,依次向2 ml离心管中 (已加入了20 μl质粒) 加入200 μl原生质体和220 μl 40% PEG4000溶液,立即轻柔上下颠倒混匀并计时。室温放置20 min。
- 向2 ml离心管中加入1 ml W5溶液,混匀,室温100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。用1 ml移液枪小心吸走上清,再加1.5 ml W5,28 °C暗培养12-16 h (不要短于8 h或者超过24 h)。
- 观察前,以室温,100 x g转速,加速、减速加速度为2,离心10 min。吸走上部液体,仅留底部200 μl细胞。轻轻混匀,在Confocal显微镜下观察荧光。
溶液配方
- 2 M Mannitol (Sigma, FW: 182.17)
36.434 g加ddH2O定容至100 ml,微波加热溶解
- 0.2 M KCl (Sangon, FW: 74.55)
1.491 g加ddH2O定容至100 ml
- 1 M CaCl2 (BBI, FW: 147.02)
14.7 g加ddH2O定容至100 ml
- 0.5 M MgCl2 (Sigma, FW: 95.21)
4.76 g加ddH2O定容至100 ml
- 1.54 M NaCl (BBI, FW: 58.44)
8.99 g加ddH2O定容至100 ml
- 0.1 M MES KOH, pH 5.7
称取MES hydrate (Sigma, FW: 195.24) 1.952g加ddH2O溶解,加KOH调至pH 5.7,定容至100 ml酶解液(Enzyme solution,现用现配)
Enzyme solution (终浓度)
| 10 ml所需母液
|
0.6 M Mannitol
| 3 ml 2 M Mannitol
|
10 mM MES (pH 5.7)
| 1 ml 0.1 M MES
|
Cellulose RS (1.5%)
| 0.15 g
|
Macerozyme (0.75%)
| 0.075 g
|
搅拌溶解,55 °C加热10 min,自然冷却,再加入以下试剂
0.1% BSA
| 0.01 g
|
1 mM CaCl2
| 10 µl 1 M CaCl2
|
ddH2O
| 6 ml
|
- W5 solution (100 ml)*
W5 solution终浓度
| 所需母液
|
154 mM NaCl
| 10 ml (1.54 M NaCl)
|
125 mM CaCl2
| 12.5 ml (1M CaCl2)
|
5 mM KCl
| 2.5 ml (0.2 M KCl)
|
2 mM MES (pH 5.7)
| 2 ml (0.1 M MES, pH 5.7)
|
用ddH2O定容至100 ml
- MMG solution*
MMG solution终浓度
| 100 ml所需母液
|
0.6 M Mannitol
| 30 ml 2 M Mannitol
|
15 mM MgCl2
| 3 ml 0.5 M MgCl2
|
4 mM MES (pH 5.7)
| 4 ml 0.1 M MES(pH 5.7)
|
用ddH2O定容至100 ml
*注:W5和MMG平时存放于4℃冰箱,只要没有被细菌或真菌污染,就可以继续使用。
- 40 % PEG 4000溶液
40% PEG终浓度
| 5 ml所需母液
|
40 % PEG4000
| 2g
|
0.6 M Mannitol
| 1.5 ml x 2 M Mannitol
|
100 mM CaCl2
| 0.5 ml x 1 M CaCl2 |
加ddH2O至5 ml
PEG需要用微波炉稍微加热溶解,混匀,在转化前放在37 °C温箱中保温,防止其再次凝固
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Q&A
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:江云鹤, 程珂, 赵晓波, 欧阳亦聃. (2018). 水稻原生质体的分离及转化.
Bio-101: e1010125. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010125.
How to cite: Jiang, Y. H., Cheng, K., Zhao, X. B. and Ouyang, Y. D. (2018). Isolation and Transformation of Rice Protoplasts.
Bio-101: e1010125. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010125.