实验原理:根据颈环引物的空间结构来提高反转录的特异性,从而反转录特定的small RNA,在实时定量过程中,打开颈环结构,通过通用引物和特异引物,用SYBR染料,进行定量。
引物设计(仅供参考):
以>osa-miR171a为例:
miR171a: UGAUUGAGCCGCGCCAAUAUC
RT-primer: 5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAgatattg3’
Forward primer: 5’gcgaTGATTGAGCCGCGCC3’
Reverse primer: 5’GTGCAGGGTCCGAGGT3’
实验目的:检测水稻各种组织中的small RNA的表达量,特别是样品很少的材料。
关键词: Small RNA, Stem-loop RT, Real-time PCR, 颈环结构, SYBR
材料与试剂
- 各种规格枪头 (RNase free及一般枪头)
- 96孔板
- DEPC水
- DNase I (NEB, catalog number: M0303S)
- SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen, catalog number: 18080-044)
- RR I (Takara, catalog number: D2313A)
- SYBR Premix Ex TaqTM (Takara, catalog number: DRR041A)
- EDTA
仪器设备
- 移液器
- 9700 PCR仪(ABI)
- 7500 Real time PCR仪(ABI)
- 离心机
实验步骤
- 2.2 μg总RNA稀释到5 μl,加入1 μl DNase I,1 μl DNase I buffer和3 μl DEPC水。于37 °C孵育10 min,加入1 μl 50 mM EDTA,65 °C孵育10 min。将处理好的RNA稀释10倍待用。
- 每个反转录反应需0.25 μl引物,0.25 μl dNTP,加上1 μl DEPC水配成混合液。
- 在96孔板中加入2 μl RNA和1.5 μl引物混合液。然后稍离心,盖上橡皮盖子。将混合液置于96孔板上65 °C孵育5 min,立即置于冰上3 min。
将1 μl 5x First strand buffer, 0.5 μl 0.1 M DTT, 0.15 μl RR I以及0.15 μl SuperScript III配制成混合液,每管中加入1.8 μl混合液。离心后,放置于PCR仪上,程序如下:
16 °C
| 30 min
|
50 °C
| 30 min
|
85 °C
| 5 min
|
25 °C
| 1 min
|
- 将反转录产物置于-20 °C过夜,或者立即进行定量分析。
- 将1 μl通用反向引物和1 μl特异正向引物加入1.5 μl灭菌双蒸水,配制成混合液,分加至每管中,并且加入12.5 μl real time试剂。贴上膜后,于离心机中稍微离心。
- 放置于ABI 7500中程序如下
95 °C
| 10 sec
|
95 °C
| 5 sec
|
60 °C
| 34 sec
|
后两步40个循环,加上标准溶解曲线程序。
参考文献
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., Lao, K. Q., Livak, K. J. and Guegler, K. J. (2005). Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33(20): e179.
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