实验原理:实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)是在常规PCR技术基础上发展而来的一种核酸定量技术。其基本原理是在常规PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加,从而对PCR产物进行实时监测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析和检测。相较于常规PCR而言,实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量分析,而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点。
实验目的:目前实时荧光定量PCR技术正广泛应用于基因表达分析,等位基因分析,CHIP结果分析,转基因生物检测等领域,成为最为重要的核酸扩增和检测手段之一。本文仅以水稻表达谱分析为案例进行阐述。
关键词: 荧光实时定量PCR, Real-time PCR, 基因表达
材料与试剂
- 实时荧光定量PCR板及膜 (ABI)
- 0.6 ml及1.5 ml tubes (AXYGEN)
- 20 µl、200 µl及1 ml tips (AXYGEN)
- SYBR premix Ex Taq (TaKaRa)
仪器设备
- 2.5 µl、10 µl、20 µl、200 µl、1 ml移液器
- 实时荧光定量PCR仪 (ABI公司,7500实时荧光定量PCR仪)
注:目前市面有多种实时荧光定量PCR的平台,如ABI公司的7500,罗氏公司的LightCycler 480,伯乐公司的ICycler等,本文以本实验室用到的ABI公司的7500实时荧光定量PCR仪为例进行阐述。
- 离心机
- 紫外分光光度计
实验步骤
- cDNA准备,根据不同的研究目的,对水稻各个发育时期的组织进行取样,例如叶片,叶鞘,根,茎,幼穗等,进行RNA抽提和反转录得到cDNA,并用内参基因(如Actin, Ubiquitin等)对cDNA进行常规RT-PCR扩增,确保cDNA质量和浓度基本一致。
- 引物设计,实时荧光定量PCR扩增片段的设计一般遵循以下原则:
- 准备反应体系,在准备好cDNA样品和引物之后,即可制备样品表。一般每个样品会设置三个重复,同时设置三个重复的内参基因对照。按如下体系配置PCR反应:
按如下体系分别配制Mix1, Mix2和Mix3,并按先后顺序加入cDNA (Mix1),引物(Mix2)和SYBR Green I/ROX (Mix3)。每个样品设置三个目的基因和内参基因的技术重复。
注:
- 运行反应程序如下
- 结果分析
先对溶解曲线进行分析,单峰的熔解曲线被认为是合格的扩增,而出现双峰等情况则可能在扩增中出现了非特异扩增及二聚体等情况 (图1)。
图1. 荧光定量PCR引物溶解曲线图例
生成文件,以CT值进行相对表达量的计算。
注:计算公式及原理参考Livak等2001.
注意事项
- 为减少技术重复间的标准误,使用确认已校准的移液器,推荐对应移液器为Real-time PCR专用。
- 目的基因的CT值在20-35之间较好,如果CT值较大,说明基因表达量较低,可适当提高模板浓度。
- 为了节约试剂成本,反应体系可缩减至10 µl。
- 为防止机器对实验结果的影响,做Real-time PCR时务必保持PCR板的洁净,不要在PCR板侧壁做标记或在机器旁打开有荧光的物质。
- Real-time PCR引物应做预实验确定其是否特异扩增。
参考文献
- Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods 25(4): 402-408.
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Q&A
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:翁小煜, 都浩, 欧阳亦聃. (2018). 利用荧光实时定量PCR技术进行表达谱分析.
Bio-101: e1010115. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010115.
How to cite: Weng, X. Y., Du, H. and Ouyang, Y. D. (2018). Analysis of Expression Profiles Using Real-time PCR.
Bio-101: e1010115. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010115.