Detection of DNA Methylation by Bisulfite-sequencing, Restriction Enzyme Digestion-PCR and Restriction Enzyme Digestion-Sourthern   

材料与试剂

1. PCR管
   
2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
3. 高质量基因组抽提试剂盒，常用的如DNeasy plant mini kit
   
4. 重亚硫酸盐处理试剂盒，常用的如EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN, catalog number: 59104)

仪器设备

1. PCR仪
   
2. 移液器
   
3. 离心机
   
4. 水浴锅
   

实验步骤

1. 高质量DNA样品抽提：目前基本都是使用商业化的试剂盒，常用的如DNeasy plant mini kit，处理方法参照试剂盒说明书。
   
2. DNA样品处理：目前基本都是使用商业化的试剂盒，常用的如EpiTect Bisulfite Kit，处理方法参照试剂盒说明书。
   
3. 引物设计：针对检测的目标区域设计PCR引物，一般有专门的软件可供使用，如 MethPrimer等，可参考文献Li and Dahiya (2002), Tusnady等(2005)。
   
4. PCR扩增和产物克隆：以重亚硫酸盐处理后的DNA为模板扩增，回收PCR产物后克隆的T载体上，挑取30个以上的阳性克隆进行测序，保证至少30个有效克隆(即重亚硫酸盐成功转化的DNA片段连进载体得到的克隆)。
   
5. 结果分析：结果分析网站http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl，分别建立两个文本文档，一个为目标区段的基因组序列，一个为测序的结果，将序列以FASTA格式保存，如图1为目标区段的参考序列形式，图2为测得的序列形式 (测序结果直接复制到该文件中，不需要任何处理，分析软件会自动去掉不匹配的序列)，分别将这两个文档上载到“Reference sequence file”和“Comparison sequences file”选项中；结果运行完成后，根据需要选择不同的表现形式(视频1)。
   
   
   
   视频1. 结果输出操作示例
   
   
   1)

   准备工作：核酸比对工具(这里示意为Bioedit)、所测DNA片段的基因组序列 (不包括引物序列)、BS-clone后sanger测序得到的序列。

   1. 将基因组序列和BS-clone后测序所得到的序列导入到Bioedit中(图1)。
      
      
      图1. Bioedit显示参考基因组序列以及测序序列
      
      
   2. 通过将BS-clone得到的序列与基因组序列进行比对(图2)，然后将我们所需要的目标区域的BS-clone得到的序列复制出来粘贴到另一个新建的文本文件中(图3)。
      
      
      图2. 参考基因组序列以及测序序列对比
      
      
   2)

   在线计算DNA胞嘧啶甲基化水平

   1. 输入文件与方法一不同的地方使我们需要将基因组序列和BS-clone得到的序列分为两个文件，且此方法不需要预先处理序列，直接拿测回得到的序列进行分析即可。
      
   2. 打开网站kismeth http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl，然后按照如下图(图3)步骤进行。
      
      
      图3. 导入参考基因组序列以及测序序列
      
      
   3. 显示页面就包含了CG、CHG、CHH甲基化比例的具体信息(图4)，以及每个位点的甲基化比例的柱状图(图5)，让人看起来一目了然。当然也包括像方法一展示的那样的dotplot图(图6)。可以看出方法二比方法一是要简便很多，但是如果要追求dotplot图的美观，选方法一更优。
      
      
      图4. CG、CHG和CHH序列整体甲基化比例
      
      图5. 每个位点的甲基化比例(柱状图)
      
      图6. 每个位点的甲基化比例(斑点图)

注意事项

1. DNA样品处理要完全，否则未处理完全的胞嘧啶会被错当作甲基化的，可以通过检测一些已知是否发生DNA甲基化的序列来判定是否处理完全，可参考文献Wang等(2011). 但是处理的太过会造成DNA的过度断裂，影响PCR扩增。
   
2. 处理会造成的序列的改变和DNA的断裂，设计引物时无法知晓匹配的位置是C还是U，因此可以在有胞嘧啶的位置以简并引物代替；若软件无法得到合适的引物，可参考文献Henderson等(2010)手动设计。
   
3. 若PCR扩增遇到困难，可采用Touch-down、Nested-PCR等方法，根据个人经验效果比较好的是Nested-PCR，即在目标区域外围设计一对引物，降低退火温度，牺牲特异性以换取扩增产物，再用目标引物进行正常扩增。如果利用Nested-PCR，在用外围引物进行扩增时，可能得到弥散的DNA带，这个属于正常现象；将此步的PCR产物，作为下一步PCR的模板进行扩增。注明在第一轮PCR的时候，尽可能选择较低的退火温度；在第二轮PCR扩增的时候，如果有条件可以，可以梯度设置PCR仪器的退火温度，寻找目标带清晰，且杂带较少的PCR扩增条件。
   
4. 一般地，如果所研究的物种有参考基因组以及DNA胞嘧啶甲基化图谱，可以下载图谱的可视化文件，在IGV等软件中搜寻目标区域，查看其DNA甲基化水平，并结合该区域附近的转座子以及sRNA富集情况综合考虑引物设计位置。
   
   
   

方法二: 酶切-PCR

实验原理：不同的限制性内切酶对其识别序列中C的甲基化的敏感程度不同，如以对甲基化敏感的限制性内切酶消化基因组DNA，若其识别序列发生了DNA甲基化则无法完成切割，再以此DNA为模板进行PCR扩增就可以得到目标条带，反之则无法扩增，从而判断该区段的相对DNA甲基化情况。相比较重硫酸盐测序，该方法操作简单，但分辨率不够。
实验目的：一般以下情况使用该方法：定性检测目标区段的DNA甲基化。
关键词：DNA甲基化，内切酶消化，PCR

材料与试剂

1. PCR管
   
2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
3. 限制性内切酶，常用的如：HaeIII (NEB，R0108)、HpaII (NEB，R0171)、MspI (NEB，R0106)、McrBC (NEB，M0272)等
   
4. 琼脂糖
   
5. PCR引物
   

仪器设备

1. 移液器
   
2. PCR仪
   
3. 电泳装置
   

实验步骤

1. 高质量基因组DNA抽提。
   
2. 取500 ng DNA，加入20 U的McrBC完全酶切。
   注：酶的具体用量和酶切时间请参考特定的内切酶的说明书，但是要保证完全酶切。
   
3. 以特异的引物进行PCR扩增。
   
4. 琼脂糖凝胶电泳。OsDRM2是一类负责维持CHH序列甲基化的DNA甲基转移酶，osdrm2的缺失导水稻全基因组CHH序列的大量丢失；如图7所示，利用野生型(WT)和osdrm2突变体材料，利用HaeIII消化酶切，选取某个位点设计引物进行PCR扩增。由于control中并没有加入HaeIII，所以WT和osdrm2突变体的PCR产物亮度一致，也说明酶切体系中DNA的量一致。在HaeIII加入的体系中，osdrm2突变体亮度消失。由于HaeIII是一种DNA甲基化敏感酶类，无法消化高甲基化区域，但是可以消化GGCC序列，因此在osdrm2突变体中该区域相比于野生型CHH甲基化修饰，从而可以被HaeIII消化。
   
   
   图7. 水稻野生型及突变体HaeIII及McrBC酶切PCR示意图(来自Tan等，2016 [Plant Physiology, 171:2041-2054)。OsDRM2是一种负责维持CHH序列甲基化的DNA甲基化转移酶，osdrm2是其功能缺失型突变体，WT为其野生型；control为不加HaeIII的反应体系。
   

注意事项

1. 结果分析时，不同的酶性质不一样，如McrBC特异切割甲基化的识别序列，而HpaII则对甲基化敏感。
   
2. 植物中的DNA甲基化分为CG、CHG和CHH (H=A, T, C)，一般分别用HpaII、MspI和 HaeIII加以区分。
   
   
   

方法三: 酶切-Southern blot

实验原理：与酶切-PCR类似，将内切酶消化后的基因组DNA进行Southern blot分析，检测DNA甲基化情况。
实验目的：一般以下情况使用该方法：定性检测目标序列的DNA甲基化；为了研究目的基因是否影响DNA甲基化，可以此方法检测5S rDNA、着丝粒等具代表性的DNA序列的甲基化。
关键词：DNA甲基化，内切酶消化，Southern blot，5S rDNA，着丝粒

材料与试剂

1. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml)
   
2. 限制性内切酶，常用的如：HaeIII (NEB，R0108)、HpaII (NEB，R0171)、MspI (NEB，R0106)、McrBC (NEB, M0272) 等
   

仪器设备

1. 移液器
   
2. PCR仪
   
3. 电泳装置
   

实验步骤

1. 取5-10 μg基因组DNA，分别加入 10 U的HpaII、MspI和 HaeIII，37度酶切3小时左右，反应进行到2小时时即可取样进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的消化情况，酶切判断标准同一般的Southern blot。
   
2. 后续步骤同Southern blot (见实验方案Southern Blot [吴昊等，2018])。
   
3. 结果分析：以5S rDNA为例，见图8，HpaII和MspI识别同样的序列CCGG，HpaII对2号位C的甲基化敏感而MspI对2号位的不敏感，对1号位的C敏感，因此分别用于识别CG和CHG甲基化。由图8可知，HpaII没有消化DNA而MspI消化了，说明CG甲基化程度高而CHG甲基化程度相对较低；再比较MspI处理的三个材料，从左至右DNA被消化的程度越来越高，说明CHG甲基化程度逐次降低。
   
   
   图8. 野生型以及kyp、cmt突变体酶切southern-blot示意图(来自Jackson等, 2002 [Nature, 416:556-560])
   

参考文献

1. 吴昊等.(2018). Southern Blot. Bio-101 e1010104. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010104. (in press)
   
2. Chen, X., Liu, X., Zhao, Y. and Zhou, D. X. (2015). Histone H3K4me3 and H3K27me3 regulatory genes control stable transmission of an epimutation in rice. Sci Rep 5: 13251.
   
3. Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L. and Jacobsen, S. E. (2010). Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics 5(1): 47-49.
   
4. Jackson, J. P., Lindroth, A. M., Cao, X. and Jacobsen, S. E. (2002). Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase. Nature 416(6880): 556-560.
   
5. Li, L. C. and Dahiya, R. (2002). MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 18(11): 1427-1431.
   
6. Southern, E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98(3): 503-517.
   
7. Tan, F., Zhou, C., Zhou, Q., Zhou, S., Yang, W., Zhao, Y., Li, G. and Zhou, D. X. (2016). Analysis of Chromatin Regulators Reveals Specific Features of Rice DNA Methylation Pathways. Plant Physiol 171(3): 2041-2054.
   
8. Tusnady, G. E., Simon, I., Varadi, A. and Aranyi, T. (2005). BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res 33(1): e9.
   
9. Wang, J., Wang, C., Long, Y., Hopkins, C., Kurup, S., Liu, K., King, G. J. and Meng, J. (2011). Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods 7: 39.