实验原理:植物体内的DNA通常在细胞核中以核蛋白的形式存在,利用阳离子去垢剂CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵) 与剧烈的高低温差破坏细胞膜结构使这些核蛋白释放出来。利用氯仿等有机试剂去除蛋白、多糖、酚类等杂质,且DNA在高盐 (1 M NaCl溶液) 条件下可溶,最后使用高浓度酒精溶液重新沉淀获得高质量的植物基因组DNA。
实验目的:大量提取植物基因组DNA,可用于Southern blot分析,对转基因植株进行外源基因插入拷贝数和整合模式检测等。
关键词: 总DNA, 大样抽提, Southern blot
材料与试剂
- 10 ml离心管
- 水稻叶片
- CTAB粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J)
- Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装)
- EDTA, pH 8.0 (国药)
- NaCl (国药集团有限公司,分析纯)
- 异戊醇
- 液氮
- 氯仿/异戊醇 (24:1)
- 10% CTAB
- RNase
- 75%乙醇
- 琼脂糖
- 1.5х CTAB (见溶液配方)
- 10% CTAB (见溶液配方)
- 1% CTAB (见溶液配方)
- 氯仿/异戊醇24:1 (体积比) (见溶液配方)
- 1 M NaCl溶液 (见溶液配方)
- TE buffer (见溶液配方)
仪器设备
- 水浴锅
- 通风橱
- 离心机
实验步骤
- 取1 g生长旺盛的水稻植株叶片,于液氮中迅速研磨成粉。
注意:请用冰盒取样,如不能立即抽提可保存于-20 °C。建议取样后尽快抽提,避免样品DNA降解。将粉末转移至10 ml离心管中,加入2 ml (枪头需提前划好刻度以免因受热后吸取过量)煮沸的1.5х CTAB (保持高温)。 - 65 °C温浴30 min。
- 检查样品顺序,在通风橱内加入等体积 (氯仿腐蚀性很强且易挥发,对移液器损害很大,可使用玻璃滴管) 的氯仿/异戊醇 (V/V=24:1),盖紧管盖,仔细检查保证每个离心管不漏液,轻缓颠倒混匀25 min,3,000 rpm离心15 min。
- 打开管盖,转移上清液于另一10 ml离心管中,加入1/10体积 (约200μl) 的10% CTAB (提前于65 °C温浴),再加入等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24:1),轻缓颠倒混匀20 min,3,000 rpm离心15 min。
- 用移液器吸上清 (如果使用1 ml的枪头,需提前剪去大约7 mm的枪尖,吸取上清时会更加平缓) 转移到于离心管,加入5 ml 1% CTAB,充分混合均匀后,静置10 min看见离心管中絮状DNA聚集,3,000 rpm离心15 min。
- 弃上清,每管加入1 ml 1 M NaCl溶液和1 µl 100 µg/ml RNase (可根据所需量提前配好Mixture),65 °C溶解1 d。
- 加入3 ml -20 °C预冷的无水乙醇 (95%乙醇也可),充分混合均匀后可见絮状DNA沉淀。
- 用枪头将DNA沉淀转至新的1.5 ml离心管中,用75%的乙醇洗涤沉淀,10,000 rpm离心5 min。
- 弃上清,晾干后溶于50 µl-100 µl TE中,溶解至少1周。
注:如果需要较长时间保存DNA用TE溶解;如果仅较短时间保存DNA可直接用灭菌双蒸水溶解。
- 取1 µl DNA溶液用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA质量,剩余DNA于-20 °C保存备用。
溶液配方
- 1.5х CTAB
15 g
| CTAB粉末 (Bio Basic Inc. GB0308BJ011J)
|
75 ml
| 1 M Tris-HCl, pH 8.0 (进口分装)
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30 ml
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 (国药)
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61.4 g
| NaCl (国药集团有限公司,分析纯)
|
定容1 L,搅拌溶解2 h
- 10% CTAB定容1 L,搅拌溶解过夜,使用前65 °C水浴预热
- 1% CTAB
10 g
| CTAB粉末
|
50 ml
| 1 M Tris-HCl, pH 8.0
|
20 ml
| 0.5 M EDTA, pH 8.0
|
定容1 L,搅拌均匀
- 氯仿/异戊醇24:1 (体积比)
在500 ml氯仿中加入22 ml异戊醇
- 1 M NaCl溶液
NaCl 58.44 g,加双蒸水溶解,定容1 L,分装后灭菌
- TE buffer
5 ml
| 1 M Tris-HCl, pH 8.0
|
1 ml
| 0.5 M EDTA, pH 8.0
|
加双蒸水溶解,定容500 ml,分装后灭菌
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Q&A
Copyright: © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用格式:吴昊, 陈太钰, 林拥军, 陈浩. (2018). 水稻叶片高质量DNA抽提.
Bio-101: e1010102. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010102.
How to cite: Wu,
H., Chen, T. Y., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). High-quality DNA Extraction from Rice Leaves.
Bio-101: e1010102. DOI:
10.21769/BioProtoc.1010102.