1 酵母双杂实验方法
2.1 酵母快速转化(单转&双转)
2.1.1实验材料
1)YPAD的平板;50mL YPAD的培养液(250的锥形瓶;)SD平板;
2)使用前不要灭菌的:10mg/μL ssDNA; YH2Gold的原始酵母菌株;96孔板;
3)使用前要灭菌的:
50%(W/V) PEG3500;1ML liAc;,50%(W/V) C6H12O6; d2H2O; 1.5ml离心管; 50ml离心管;镊子;黄枪头;蓝枪头;白枪头;30-60%的甘油;
2.1.2实验步骤
1)从-80℃的冰箱中取出YH2Gold的原始酵母菌株,在YPAD的平板上划线,放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。
2)2-3天后,将划线的平板上,取出。将50mL的YPAD的培养液中加入2mL 50%的C6H12O6,摇匀后,吸取1mL的培养液加入1.5ml离心管,备用。
3)用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落,将其刮在含有YPAD溶液的1.5ml离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:振荡这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,使其生长变得缓慢!)
4)将离心管中的菌液吸取到50mL的YPAD的培养液中,封好,放置在30℃,200-230rpm/min的摇床,过夜。(一般16小时左右即可进行下面的实验)
5)从过夜的培养液中吸取1.4mL到1.5ml离心管中,用离心机最大转速离心30s,弃上清,重复一次,即收集2.8mL培养液中的菌体。(一般情况下,一个转化同时做2管!)
6)向1.5ml离心管中菌体加入700mL的双蒸水,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:清洗这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起影响转化效率!)。
7)用离心机最大转速离心30s,弃上清。
8)按照如下顺序加溶液:
50%(W/V) PEG3500 | 240μL |
1ML liAc | 36μL |
10mg/μL ssDNA | 10μL |
质粒 | 4μL |
d2H2O | 70μL |
总体积 | 360μL |
如果是共转的情况,每个质粒加4μL,d2H2O只加66μL。
(注意:ssDNA在使用前,必须99℃加热10min,然后冰浴10min,在加ssDNA前必须振荡混匀!)
9)将上面步骤中所有液体加好后,在涡旋仪上振荡1min,使其充分混匀。
10)42℃水浴1小时,每隔10min,将离心管轻轻的上下颠倒几次。(这一步的目的是为了防止菌夜沉入管底,影响转化效率!)
11)用离心机最大转速离心30s,弃上清,加入200μL的d2H2O,在涡旋仪上振荡1min,使其充分混匀。
12)将200μL菌液涂在对应的单缺或者双缺的SD平板上。放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。
13)将平板上长出的酵母菌,挑选几个长势优良的,划在另一块新的SD平板上,进行扩大培养。(这一步主要是方便后面进行mating!)
14)将正确的菌用30-60%的甘油进行-80℃存放。同时如果不确定质粒是否转对,可以进行对应的酵母菌液PCR。
1.2 Mating(多用于筛库)
2.2.1实验材料
1)SD培养基(已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液):
50块SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(150mm)(一般提前2天倒好,放在超净工作台!);
2块SD/-Trp-Leu平板(90mm);
2块SD/-Leu平板(90mm);
2瓶50mL SD/-Trp的培养液
1瓶10mL SD/-Trp的培养液
2)YPAD的培养液(已经加好了对应的葡萄糖):
1* YPAD的培养液:50mL
0.5* YPAD的培养液:2瓶50 mL,2瓶10 mL;
2* YPAD的培养液:2瓶45 mL,2瓶10 mL ;
3)使用前需要灭菌的: 1.5ml离心管; 50ml离心管;2L的锥形瓶,黄枪头;蓝枪头;白枪头;50%(W/V) C6H12O6; d2H2O;镊子;
4)使用前不需要灭菌的:96孔板;含有bait的Y2HGold的酵母菌株;50μg/mL kanamycin solution ;载玻片;盖玻片;酵母文库;
2.2.2实验步骤
1)吸取1mL SD/-Trp的培养液加入1.5ml离心管,备用;
2)单转得到含有bait的Y2HGold的酵母菌株,(承接2.1.2中的13)的内容),在活化的从平板上,用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落,将其刮在含有SD/-Trp溶液的1.5mL离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:振荡这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,使其生长变得缓慢!)
3)将离心管中的菌液吸取到SD/-Trp的培养液中,封好,放置在30℃,200-250rpm/min的摇床,过夜。直到OD值到达0.8(16-20小时)。(注意:根据实验经验,OD值在0.75-0.8之间的mating效率最好!)
4)用50 mL离心管收集菌液, 1000g/min ,离心3min, 弃上清。
5)从10mL SD/-Trp的培养液吸取1-2mL,悬浮菌体,加入2L的锥形瓶中。
6)按照上一步,重复悬浮两次,确保大部分菌体都加到2L的锥形瓶中。
7)向45 mL 2* YPAD的培养液加入50μL 50μg/mL Kanamycin,向10 mL 2* YPAD的培养液加入10μL 50μg/mL Kanamycin。
8)将融化(注意:因为酵母文库放在-80℃冰箱,提前半个小时将其取出,都放在冰上融化后,在放置在室温10min以上!)的酵母文库吸取10μL进行梯度实验,其余的酵母文库都加到2L的锥形瓶中。
文库梯度实验: a: 将10μL菌液加到990μL d2H2O,振荡1min; b:从a吸取100μL液体到900μL d2H2O,振荡1min; c:从b吸取100μL液体到900μL d2H2O,振荡1min,吸取100μL液体涂在SD/ -Leu平板;(浓度:1*10-5mL); d: 从c吸取100μL液体到900μL d2H2O,振荡1min,吸取100μL液体涂在SD/- Leu平板;(浓度:1*10-6mL); 将2块SD/ -Leu平板放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。 |
9)从10 mL 2* YPAD的培养液(加有Kanamycin)吸取1mL, 悬浮菌体,加入2L的锥形瓶中
10)按照上一步,重复悬浮两次,确保文库都加到2L的锥形瓶中。(注意:尽量使用同一个枪头文库中所有的菌液都加到2L的锥形瓶,不然会影响双杂效果!)
11)将45 mL 2* YPAD的培养液(加有Kanamycin)加到2L的锥形瓶中,封好。
12)放置在30℃,30-50rpm/min的摇床,过夜。(20-24小时)。
13)20小时后,可以取10μL的mating菌液,放在显微镜(40*)下检测,观察是否大规模的出现了像“米老鼠的脸”这样的两个酵母粘在一起的现象,如果出现可以进行下一步,如果没有,则继续在摇床上培育4小时。(一般为了防止菌液的浪费,只有第一次mating时,进行镜检,如果第一次筛库成功,第二次至最后一次筛库,可以不需要镜检!)
14)向2瓶50 mL 0.5* YPAD的培养液加入50μL 50μg/mL Kanamycin,向10 mL 0.5* YPAD的培养液加入10μL 50μg/mL Kanamycin。
15)用50 mL离心管收集mating菌液,编为1号离心管;然后用50 mL 0.5* YPAD的培养液(加有Kanamycin)冲洗2L的锥形瓶,收集冲洗的菌液,编为2号离心管;再重复冲洗一次,收集冲洗的菌液,编为3号离心管。
16)将3瓶菌液,1000g/min ,离心3min, 弃上清。
17)从10 mL 0.5* YPAD的培养液(加有Kanamycin)吸取0.8 mL, 悬浮3号管中菌体,加到1号管中,再重复二次,加到1号管。(注意:尽量使用同一个枪头!)
18)按照上一步,悬浮2号管,加到1号管,再重复二次,加到1号管。(注意:这样做可以尽量减少菌液的损失,减少对酵母双杂的结果的影响!并且尽量使用同一个枪头!)
19)再将1号管的菌液悬浮起来,将10 mL中剩下的 0.5* YPAD的培养液加到1号离心管中,混匀,吸取10μL进行梯度实验。将剩下的菌液涂到50块SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(150mm)。(每次涂布前,吸取的菌液要混匀,涂布的过程尽量快速,因为菌液干的比较快!)
mating梯度实验: a: 将10μL菌液加到990μL d2H2O,充分混匀, 吸取100μL液体涂在SD/-Trp-Leu平板;(浓度:1*10-4mL); b:从a吸取100μL液体到900μL d2H2O,充分混匀后,吸取100μL液体涂在SD/-Trp-Leu平板;(浓度:1*10-5mL) 将2块SD/-Trp-Leu平板放置在30℃的培养箱中,培养2-3天。 |
20)将50块SD平板放置在30℃的培养箱中,培养5-15天。
2.2.3 mating效率计算
由于本人数学不佳,直接采取举例的方法:
公式:
效率=1 mL mating菌液中菌的数目/1 mL文库中菌的数目*100%
假设:
在文库梯度实验中,在浓度为1*10-5mL的平板上有200个菌落;在浓度为1*10-6mL的平板上有34个菌落;取200为有效数字,则1 mL文库中菌的数目为:2*107个。
在mating梯度实验中,在浓度为1*10-4mL的平板上有100个菌落;在浓度为1*10-5mL的平板上有7个菌落;取150为有效数字,则1 mL mating菌液中菌的数目为:1*105个。
则mating效率为1*105个/2*107个*100%=5%
(注意:酵母筛库成功的检验方法:在文库酵母数目大于2*107个的前提下,mating效率大于2%,即本次筛库过程中,发上了共转的酵母超过1百万个!)
1.3 筛到酵母检测
2.3.1实验材料
1)SD培养基(已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液):
SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(150mm)
SD/-Trp-Leu-His-Ade平板(90mm)
SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板(90mm)
SD/-Trp-Leu/平板(90mm)
10mL SD/-Trp-Leu的培养液
2)使用前需要灭菌的: 1.5ml离心管; 50ml离心管;黄枪头;蓝枪头;白枪头;50%(W/V) C6H12O6; d2H2O;镊子;
2.3.2实验步骤
1)将四缺平板上筛库得到的阳性克隆,划在另一块新的SD/-Trp-Leu/平板(90mm)上,进行扩大培养。
2)吸取1mL d2H2O加入1.5ml离心管,备用。
3)从扩大培养的平板上,用黄枪头挑选酵母菌落,将其刮在含有d2H2O的1.5mL离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。
4)测定对应的OD值,根据不同的检测方法,将菌液稀释到对应的OD值
(注意:检测酵母阴阳性的时候,一般采用点菌的方法,一般是吸取5μL的菌液点在平板上,因为酵母的浓度,会对结果的判断产生影响,尤其是X-α-gal的显色实验!)
a.四缺平板梯度实验:
一般将浓度稀释成OD值:0.2, 0.02, 0.002,0.0002进行点菌,放置在30℃的培养箱中,培养3-5天。
如图所示,为点菌72小时后的结果:
b. SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板实验:
一般将浓度稀释成OD值:0.2和0.5进行点菌,置在30℃的培养箱中,培养1-3天。(注意:由于X-α-gal需要避光,操作时尽量快速,平板可以用锡箔纸包着,再放到培养箱!阳性和阴性对照是必须的!)
5)将正确的酵母菌用30-60%的甘油进行-80℃存放。
1.4 酵母质粒的提取
2.4.1实验材料
1)10mL SD/-Trp-Leu培养液(50的锥形瓶)(已经加好了对应的葡萄糖和Dropout 溶液);
2)使用前不要灭菌的: 96孔板;5U/μL溶壁酶;20%SDS;小提试剂盒;
3)使用前要灭菌的:
50%(W/V) C6H12O6; d2H2O; 1.5ml离心管; 50ml离心管;镊子;黄枪头;蓝枪头;白枪头;30-60%的甘油;
2.4.2实验步骤
1) 吸取1mL SD/-Trp-Leu的培养液加入1.5ml离心管,备用。
2)用黄枪头挑选一个直径不小于2mm的酵母菌落,将其刮在含有SD/-Trp-leu溶液的1.5mL离心管中,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:振荡这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,使其生长变得缓慢!)
3)将离心管中的菌液吸取到SD/-Trp-leu的培养液中,封好,放置在30℃,200-250rpm/min的摇床,过夜(16-24小时 )。
4)从过夜的培养液中吸取0.5mL到1.5ml离心管中,加入30-60%的甘油,进行-80℃存放。
5)从过夜的培养液中吸取1.4mL到1.5ml离心管中,用离心机最大转速离心1min,弃上清,重复一次,即收集2.8mL培养液中的菌体。
6)向1.5ml离心管中菌体加入700mL的双蒸水,在涡旋仪上振荡1min,直到将酵母菌落打散。(注意:清洗这一步特别重要,酵母菌落有较多粘稠的液体,会使酵母菌聚集在一起,不能充分结合溶壁酶,从而影响质粒提取效率!)。
7)用离心机最大转速离心1min,弃上清,使剩余的液体大约50μL。
8)加入10μL的5U/μL溶壁酶 (Sigma, L2524),在涡旋仪上振荡1min,放在37℃摇床,200-250rpm/min,摇1小时。(注意:酵母细胞壁的厚度约为0.1-0.3微米,其主要组成部分为D-葡聚糖和D-甘露聚糖,所以破壁特别重要!而且以上操作都在超净工作台!)
9)加入10μL的20%SDS,在涡旋仪上振荡1min,放在-20℃,至少20min。
10)在涡旋仪上振荡1min,按照小提试剂盒的步骤,加Buffer E1直到总体积为250μL。
11)按照小提试剂盒的步骤,加250μL Buffer E2,静置10min。(静置特别重要,因为酵母的细胞壁太厚了!)
12)接下来的步骤全部按照小提试剂盒来操作。
13)将10μL的质粒转到DH5α的感受态中,再从DH5α提取质粒,送测序。
(注意:如果觉得上述步骤很繁琐,你可以购买酵母质粒提取试剂盒!)
1.5 酵母对照实验
阳性对照:Y2HGold [pGBKT7-53] & Y187 [pGADT7-T]
阴性对照:Y2HGold [pGBKT7-Lam] & Y187 [pGADT7-T]
检测是否存在自激活现象:
pGBKT7/Bait + Empty pGADT7, 是否使X-α-gal的平板变蓝,没有变蓝(菌落周围的培养基没有变蓝),则不存在这种现象。