1. 小鼠剪尾和标记
a) 新生小鼠（<P7）的剪尾和标记
i. 标记方法：用小号注射器针头沾取适量动物用刺青染料，在小鼠脚掌中心穿刺5-8次，确保染料进入伤口，以留下永久性标记。
ii. 标记顺序：标记时采取先前(F)再后(B)、先右(R)再左(L)的顺序（以下操作中的左右均以小鼠背部向上为基准），按照FR、FL、BR、BL、FRL、BRL、FRBR、FLBL、FRBL、FLBR、FRLBRL、FRLBR、FRLBL、FRBRL、FLBRL、NM（无标记）的顺序依次进行穿刺标记。小鼠数量过多时，可分雄雌或毛色分别进行标记。
iii. 剪尾方法：在洁净刀片上用记号笔划分5-8个区域，依次使用割取~2mm鼠尾放入标记好的1.5ml无菌EP管中，每只小鼠换用一个区域以避免交叉污染。
iv. 注意事项：
Ø 新生小鼠无法自行保持体温，请勿长时间在外放置，防止失温死亡。
Ø 母鼠对气味敏感，若连续处理多笼小鼠，其间需更换手套或用酒精喷手，防止小鼠染上它笼气味被母鼠攻击
Ø 鼠尾切勿割取过长！！！
Ø 剪下的组织若不立即使用，可在-20C冰冻保存数周到数月。
Ø 标记时注意避免染料附于将取组织表面，且在盖EP管时不要碰到盖内侧，以免材料被手套上的染料或其他杂质污染
b) 分笼后小鼠（>P21）的剪尾和标记
i. 标记方法：使用耳标钳（F.S.T. ear punch）在小鼠耳朵上打洞。
ii. 标记顺序：标记时采取从右到左的顺序，按照NH（无洞）、HR、HL、HRL的顺序进行标记。小鼠数量过多时，可分雄雌分别进行标记。
iii. 剪尾方法：在洁净刀片上用记号笔划分5-8个区域，依次使用割取~2mm鼠尾放入标记好的1.5ml无菌EP管中，每只小鼠换用一个区域以避免交叉污染。或用小剪刀剪~2mm鼠尾，放入标记好的1.5ml无菌EP管中，剪完一只后需用酒精消毒剪刀再剪下一只，防止基因污染
c) P7-P21小鼠的标记（如非必要，不建议采用，可能影响小鼠行动）
i. 标记方法：用右手提起小鼠尾巴将其放在笼盖上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指贴合在小鼠身体靠近尾部位置缓缓向前推进，捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心，无名指和小指压住其尾部，用小剪刀剪其脚趾根部，确保其愈合后断趾明显，留下永久标记。剪下的组织放入标记好的1.5ml无菌EP管中，剪完一只后需用酒精消毒剪刀再剪下一只，防止基因污染。
ii. 标记顺序：剪中间脚趾，采取先前(F)再后(B)、先右(R)再左(L)的顺序，按照FR、FL、BR、BL、FRL、BRL、FRBR、FLBL、FRBL、FLBR、FRLBRL、FRLBR、FRLBL、FRBRL、FLBRL、NM（无标记）的顺序依次进行。
2. DNA模板制备
a) 蛋白酶K消化：
i. 在鼠尾裂解液中加入蛋白酶K（100X蛋白酶K溶液1:100稀释，即配即用），颠倒混匀，低速离心。
ii. 在装有鼠尾或其它组织的EP管中加入50μl混合液，13300rpm离心3min，确保组织完全没入液面以下。
iii. 55℃烘箱消化过夜。
b) 蛋白酶K灭活（多数样品适用）：
i. 将烘箱温度调至90℃，保温1h，令蛋白酶K变性失活。
ii. 13300rpm离心10min，令组织残渣沉淀，取上清作为PCR模板。
iii. 来源幼鼠的PCR模板可在4C保存一周至数周；来源成年鼠的PCR模板杂质较多，不宜长时间保存。
c) DNA简单纯化（PCR不稳定或产物长度>1.5kb样品适用；纯化前请勿90℃灭活！）
i. 在装有鼠尾或其它组织的EP管中加入50μl含蛋白酶k的鼠尾裂解液，13300rpm离心3min，确保组织完全没入液面以下。
ii. 55℃烘箱消化过夜。
iii. 13300rpm离心10~15min，将上清转移到新管中，以去除毛发骨头等各类杂质。
iv. 向EP管中加入450μl miniQ H2O和50μl3M醋酸钠（终体积的1/10），充分混匀，13300rpm离心10min。
v. 在不触动沉淀的前提下，将上清用200μl移液枪转移至新的EP管中，加入预冷的异丙醇500μl，轻柔颠倒混匀，可观察到絮状DNA析出。
vi. 13300rpm4度离心10~15min，观察到管底部或侧面有白色沉淀。
vii. 小心吸弃上清，加入800μl的75%乙醇于EP管中，轻柔颠倒EP管，清洗沉淀，13300rpm离心10min。
Ø 清洗后DNA沉淀会变松，极易丢失，离心后需确认沉淀回到管底。
viii. 小心吸去75%乙醇，切勿将沉淀吸入枪头。
ix. 低速离心10s，用10μl枪将液体尽量吸干。
x. 开盖晾干沉淀。
Ø 晾干后DNA会变透明，溶解时需确保将水滴于DNA所在处。
xi. 待闻不到明显酒精气味时，加入50μl miniQ H2O，反复吹吸至DNA充分溶解。
d) DNA酚氯仿抽提（PCR不稳定或产物长度>1.5kb样品适用；纯度高，可较长期保存；抽提前请勿90℃灭活！）
i. 在装有鼠尾或其它组织的EP管中按照1:10的质量体积比加入含蛋白酶k的鼠尾裂解液，13300rpm离心3min，确保组织完全没入液面以下。
ii. 55℃烘箱消化过夜。
iii. 13300rpm离心10~15min，将上清转移到新管中，以去除毛发骨头等各类杂质。
iv. 如体积不足200 μl，用miniQH2O将体积补足到200 μl。若多于，则不必补。
v. 加入1倍体积酚氯仿，手动剧烈摇晃混匀15-30s。
vi. 13300rpm4度离心10~15min，将上清转移到新管中。吸取时速度要慢，枪头不能接触中间层（蛋白质层），宁少勿多，杜绝污染。
vii. 加入1倍体积氯仿，手动剧烈摇晃混匀15-30s。
viii. 13300rpm4度离心10~15min，将上清转移到新管中。吸取时速度要慢，枪头不能接触下层，宁少勿多，杜绝污染。
ix. 加入1/10体积的3M醋酸钠，1倍体积异丙醇（或3倍体积乙醇）。
x. 轻柔颠倒混匀，可观察到絮状DNA析出。
xi. 13300rpm4度离心10~15min，观察到管底部或侧面有白色沉淀。
xii. 小心吸弃上清，加入800μl的75%乙醇于EP管中，轻柔颠倒EP管，清洗沉淀，13300rpm离心10min。
Ø 清洗后DNA沉淀会变松，极易丢失，离心后需确认沉淀回到管底。
xiii. 小心吸去75%乙醇，切勿将沉淀吸入枪头。
xiv. 低速离心10s，用10μl枪将液体尽量吸干。
xv. 开盖晾干沉淀。
Ø 晾干后DNA会变透明，溶解时需确保将水滴于DNA所在处。
xvi. 待闻不到明显酒精气味时，加入50μl miniQ H2O，反复吹吸至DNA充分溶解。
3. PCR
a) PCR体系：
i. 引物配置
Ø 13300rpm离心10min，加入适量灭菌milliQ水，溶解到100μM（储备液，体积在管壁上有标注）或20μM（工作液）。
Ø 在漩涡混合器上剧烈震荡，令引物完全溶解后短暂离心，-20℃（使用中）或-80℃（备用；侯永洁负责）保存。
Ø -80℃引物转入-20℃后，应立刻通知侯永洁订购备用管。
ii. 在PCRmix中加入酶，轻柔颠倒混匀，分装为500μl/管，-20℃保存
Ø 使用滤芯枪头、未开封新管分装，以避免污染。
Ø 用完移液枪请调回至最大量程。
iii. 配比
即配即用 | 体积 | X反应个数（样品数+阳性对照+阴性对照+空白对照）X1.05（多配5%体积补偿分装误差 | -20℃保存 | 批量配置 |
2XPCR Mix(含酶) | 10μl | 2XPCR Mix(含酶) | 500μl |
灭菌milliQ水 | 9μl | 灭菌milliQ水 | 440μl |
上游引物（20uM） | 0.1μl | 上游引物（100uM） | 5μl |
下游引物（20uM） | 0.1μl | 下游引物（100uM） | 5μl |
分装体积 | 19μl | 总体积 | 990μl |
iv. 分装入8联管（19μl/管），加入1μl模板，盖盖，桌面离心机离心10s，放入PCR仪。
Ø 从中间向两边盖，以防止不匹配或无法盖牢
Ø 注意盖子和管子的品牌是否一致，否则可能盖不紧或长度不对
b) PCR程序及优化：
i. 93-95℃预变性2-5min （温度和时间应根据订购的酶/PCR mix特性，参考说明书设定）
ii. 93-95℃变性15-30s，50-72℃退火30s，68-72℃延伸45s，循环30-35次
iii. 68-72℃延伸2-10min （温度和时间应根据订购的酶/PCR mix特性，参考说明书设定）
iv. 20℃维持（及时取出，勿长时间放置，否则会损耗PCR仪寿命）
v. 注意事项：
Ø 不同公司的酶对变性温度及时间、延伸温度及时间的要求不同，请按说明书操作！
Ø 退火温度（Ta）可根据引物Tm进行调整(一般Ta≤Tm-5)
Ø 延伸时间根据产物长度进行调整
Ø 出现杂带可适当升高Ta，必要时进行梯度PCR测试最佳Ta
c) PCR产物可在4℃保存数天-数周。
4. 电泳与成像
a) 凝胶制备：
i. 称量适量琼脂糖，加入1×TAE电泳缓冲液（注意不是PBS！），摇晃混合
Ø 若需分辨1kb以上的PCR产物，可用<1%的琼脂糖
Ø 300bp-1kb PCR产物，可用1%-1.5%琼脂糖（1g-1.5g琼脂糖/100mlTAE）
Ø 若需分辨200bp左右PCR产物（例如分离210bp与250bp），需用1.5-2%琼脂糖
ii. 微波加热直至溶液清澈透明无悬浮物。
Ø 注意：每加热15s-30s拿出摇晃，防止溶液过热发生喷溅。
Ø 若使用核酸染料，全融后需等待~5min、没有明显蒸气后再加入染料，以防染料挥发；每100ml加入0.5μl染料，摇晃混匀后使用。
iii. 适当冷却后倒入胶槽，插入梳子（避免梳子被烫弯）
Ø 注意：一般中型琼脂糖可插3排梳子
iv. 待完全凝固（变白）后方可拔掉梳子；若急用可放入4℃冷柜加速降温。
v. 不立刻使用的凝胶可用保鲜膜包裹，在4度保存1周-1月。
b) 电泳
i. 检测电泳仪中的电泳缓冲液是否干净、液面高度是否足够，决定是否需要更换或添加电泳缓冲液。
ii. 将凝胶放入电泳仪中，确保缓冲液完全没过胶孔，且孔中无气泡。
iii. 用专用移液枪在每孔加入8μl完成的PCR体系
Ø 注意：切勿使用配置PCR体系的移液枪加样，防止污染！！！
iv. 在合适的位置加入5μl marker，每排至少加一孔。
v. 设置合适的电压与时间，进行电泳。一般使用120V，电泳25min。
vi. 注意事项：
Ø 负极（黑色）总是接在上样孔一侧；DNA带负电，往正极跑。也要注意检查电源输出端连接是否正确（红色插红色孔、黑色插黑色孔）
Ø 不使用的胶可预先切下，或电泳结束后切下，下次直接使用或重新融化制胶。
c) 成像：
i. 若采用EB染色（11楼公共实验室），需将凝胶放入EB溶液（20mg/ml EB，1：100,000稀释）中浸泡30min，然后放入成像系统中观察拍照。
Ø 若泡胶用EB溶液过脏，需重配更换
ii. 若采用核酸染料进行电泳，在1016房间Biorad成像系统进行观察拍照。
Ø 注意：核酸染料背景较EB高，但对低分子量条带的显色可能比EB敏感
5. 结果分析
a) 图像处理：
i. 在Photoshop(PS)中打开图像，菜单栏中选择“图像”à“调整”à“反相”
Ø 反相后条带呈黑色，背景呈白色
Ø 可在菜单栏中选择“图像”à“调整”à“色阶”，调整图像显示，使条带清晰可辨
ii. 在左侧工具栏中选择剪刀工具，调整图像大小和方向
iii. 在左侧工具栏中选择文字工具，标注每孔所加样品的名称（调整字体大小、粗细和颜色，保证文字清晰可辨）
iv. 存储图像
b) 图像打印和粘贴
i. 新建word文档，插入标注好的图像，调整至适合粘贴到小鼠记录上的大小
ii. 打印图像，修剪粘贴
c) 图像分析
i. 根据marker的条带判断条带大小
ii. 对照引物列表，判断条带大小是否符合预期
iii. 根据条带大小判断小鼠基因型，并及时记录