材料和试剂

1.5ml微管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：69715）}
装有28 G x½针的1 ml胰岛素注射器（BD，目录号：329420）
精密滑动针（20 G x 1）（BD，目录号：305175）
5 ml聚苯乙烯圆底管（Corning，Falcon ^®，目录号：352054）
精密滑动针（25 G x 5/8）（BD，目录号：305122）
200μl提示（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM12655）}
15毫升螺旋锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.002）
10ml注射器（BD，目录号：309604）
12孔细胞培养板（Corning，Costar ^{®，目录号：3513）}
3 ml注射器（BD，目录号：309657）
50毫升螺旋锥形管（SARSTEDT，目录号：62.547.004）
细胞过滤器（70μm尼龙）（Corning，Falcon ^{®，目录号：352350）}
60×15mm组织培养皿（Corning，Costar ^{®，目录号：353802）}
10毫升剥皮板（Corning，Costar ^®，目录号：3548）
纱布海绵（4 x 4英寸）（Pro Advantage，NDC，目录号：P157118）
0.2μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SCGPU11RE和SLGP033RS）
2.5 ml毕业转移移液器（RPI，目录号：147501-1S）
吸收垫（COVIDIEN，目录号：949）
鼠标
CD45-亮紫510（BV510）（克隆：30-F11）（BioLegend，目录号：103138）
1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190-144）}
CD90.2-APC-eFluor 780（克隆：53-2.1）（Affymetrix，eBioscience，目录号：47-0902）
异氟烷（USP吸入蒸气，液体）（药品，目录号：57319-559-06）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836）
台盼蓝溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
CD16/32-PerCP/Cy5.5（克隆：93）（BioLegend，目录号：101324）
CD4-FITC（克隆：RM4-5）（BioLegend，目录号：100510）
2,2,2-三溴乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
2-甲基-2-丁醇（Sigma-Aldrich，目录号：152463）
纳米纯水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10977015）}
RPMI培养基1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11875093）}
HEPES（1 M）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630080）
L-谷氨酰胺（200mM）100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25030081）}
胎牛血清（FBS）（Atlanta Biologicals，目录号：S11150）
MEM非必需氨基酸溶液100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11140050）}
丙酮酸钠100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11360070）}
青霉素/链霉素100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
胶原酶D（Roche Diagnostics，目录号：11088882001）
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：10104159001）
Hank的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14025）}
叠氮化钠，NaN 3（AMRESCO，目录号：0639）
碳酸氢钾，KHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：237205）
氯化铵，NH 4 Cl（Sigma-Aldrich，目录号：A9434）
EDTA-Na 2（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
BD Cytofix固定液（BD，目录号：554655）
Avertin（见食谱）
完成RPMI 1640培养基（见食谱）
消化缓冲液（参见食谱）
FACS缓冲区（见配方）
ACK裂解缓冲液（参见食谱）

设备

干燥器（SP科学软件 - 贝尔艺术产品 - H-B仪器，型号：节省空间的真空干燥器）
通风柜（LABSCAPE）
Pipetman P10（Eppendorf，型号：Research plus）
Pipetman P200（Eppendorf，model：Research plus）
Pipetman P1000（Eppendorf，型号：Research plus）
吸管辅助（Eppendorf，型号：Eppendorf Easypet 3）
加热灯（Whitehead Industrial，目录号：30715）
鼠标限制器（Braintree Scientific，目录号：TV-150 STD）
用70％乙醇喷雾瓶（SKS Science Products，目录号：0185-11）
手术剪刀（Sklar Surgical Instrument，目录号：47-1246）
镊子（Sklar Surgical Instrument，目录号：66-7644）
聚苯乙烯泡沫（普通聚苯乙烯盒顶）
摇杆（Labnet，目录号：S0500）
冷藏台式离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra 6R）
血细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，目录号：99503）
流式细胞仪（BD，型号：FACSVerse）

软件

Flowjo软件（10.0.7版）

程序

同时鼻内/血管内抗体标记（见视频1和2）
1. 稀释0.25μgCD45-BV510抗体在100μlDPBS 1.5ml微管（用于鼻内标记）。将稀释0.5μgCD90.2-APC-eFor 780抗体在另一个1.5ml微量管中的300μlDPBS中，并将抗体加载到具有28G×½针（用于静脉内标记）的1ml胰岛素注射器中。将微管和注射器放在冰上，直到使用。（见注1）
2. 将塑料干燥器放在通风橱中。将一些纱布放在底部腔室中，然后加入5ml异氟烷。（见注2）
3. 将鼠标放在干燥器内的格栅上（见注3）。
4. 加载带有100μlCD45-BV510抗体的P200微量移液器。
5. 在呼吸速度慢后，拿起小鼠，将其垂直握住并缓慢地将100μl的CD45-BV510抗体递送到小鼠鼻孔上。按住鼠标直立，使鼻孔上的液体完全吸入肺部。
6. 将鼠标放回笼子里。 2分钟后，打开笼罩上的加热灯，并将鼠标预热1分钟。
7. 将小鼠从笼中取出，将其放入小鼠限制器中，并通过尾静脉注射0.5μgCD90.2-APC-eForor 780抗体，在300μlDPBS中，用1ml在第1点制备的胰岛素注射器。
8. 从限制器释放鼠标，并通过腹膜内注射300μl的黄芩苷溶液立即麻醉小鼠。将鼠标固定在手掌中并水平握住，然后将针头插入与鼠标相切的浅角度，并慢慢地将Avertin溶液分配到腹膜腔中。
  
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  视频1.抗体的鼻内给药
  
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  视频2.抗体的静脉内施用
  
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从气道收获细胞（见视频3）

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视频3.支气管肺泡液收获，获得呼吸道居民细胞

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1. 准备1 g注射器，20 G x 1针。小心地将大约1.25英寸的20 G管道传递到针上。用剪刀剪开管道的末端。用1ml完整RPMI 1640培养基装入注射器，放在冰上直至使用（图1）
  
  图1. BALF灌洗注射器制备和手术的代表性图片
2. 当鼠标完全麻醉时，通常在2分钟内，通过用25 G x 5/8针钉扎每个肢体将其固定在一块聚苯乙烯泡沫上，吸收垫在顶部。
3. 使用装有70％乙醇的喷雾瓶润湿鼠标毛。
4. 切开覆盖腹腔和胸腔的皮肤通过下颌。用剪刀从颈部取出组织，暴露气管。
5. 使用镊子将气管与底层组织分开，并在气管下方放置200μl提示。
6. 使用剃刀切开气管的1/2。将1 ml注射器用20 G x 1针插入切口。用完整的RPMI 1640培养基灌洗4次。在冰上将15ml锥形管收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。通常3-3.5ml的BALF被回收（图1）
7. 在四台桌面离心机中，在4℃下以400×x 将细胞旋转5分钟，并将细胞重新悬浮在1ml冰冷的FACS缓冲液中（见注5）。
牺牲小鼠并从肺部收获细胞（见视频4）

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视频4.进行细胞分析的灌注和收获肺

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收集BALF后，切开腹腔露出隔膜下侧。用剪刀穿过隔膜，然后取出胸腔以彻底暴露心肺。

在冰冷的无菌DPBS上注入10ml注射器，并附上25 G x 5/8针。将针插入心脏的左心室，并顺利地将5ml DPBS注入心脏。同时，使用镊子打破右心房，让血液从流通中排出。从左心室取出针头并将其插入右心室，直接用剩余的5ml DPBS灌注肺。（见注6）

切开心脏远离肺部，然后切开气管和剩余的结缔组织后，从胸腔取出肺。

将肺置于装有2.5ml DPBS的12孔组织培养板的孔中。

用DPBS冲洗肺并将其转移到没有DPBS的另一口中。用剪刀将肺部变成非常细的碎片。

将切碎的肺用2.5ml转移移液管转移到5ml锥形管中的5ml消化缓冲液中

将管放在摇杆上，并在室温下轻轻地在黑暗中旋转30分钟。

将70μm的细胞过滤器放入60 x 15 mm的组织培养皿中

将消化缓冲液中的肺组织使用2.5ml转移移液管转移至细胞过滤器。用3 ml注射器柱塞的平端轻轻按压和离开组织通过过滤器。过滤组织，直到只有结缔组织残留在过滤器上，并用完整的RPMI 1640培养基冲洗过滤器。将得到的悬浮液转移到50ml锥形管中

在四层桌面离心机中，在4℃下以400 x x x x x x x x x X x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x

倒出上清液并将细胞重悬于3ml的ACK缓冲液中1分钟以裂解剩余的红细胞。用30毫升冰冷的DPBS中和ACK缓冲区。

在4℃下以400×g将细胞旋转细胞5分钟，并将细胞重悬于5ml冰冷的FACS缓冲液中。
细胞染色

在台盼蓝存在下使用血细胞计数器从BALF和肺计数细胞。

在4℃下以400×g将肺细胞旋转5分钟，并将细胞以每50μl100万个细胞重悬于FACS缓冲液中。

在4℃下以400×g将BALF中的细胞分解5分钟。由于从气道中回收的细胞少得多，根据需要每50μlFACS缓冲液重新悬浮1-5×10 5个细胞。

在50μlFACS缓冲液中稀释0.25μgCD4-FITC和0.1μgCD16/32抗体（见附注4）。

在FACS管中轻轻混合50μl细胞和50μl抗体。

在黑暗中孵育细胞15分钟，4℃

在4℃下，用2ml的FACS缓冲液，400℃洗涤细胞一次5分钟。

取出上清液，将细胞悬浮于100μlFACS缓冲液中

使用移液管将细胞通过70μm的细胞过滤器转移到新的FACS管中。使用流式细胞仪获取FACS数据并使用Flowjo软件分析数据（图2）。（见注7）

流式细胞仪门控策略

图2.区分气道，薄壁组织和肺血管中的CD4 ⁺ T细胞的门控策略。将记录CD4 ⁺ T细胞呼吸道，0.25μg荧光染料缀合的CD45和0.5μg荧光染料缀合的CD90.2抗体注射入经SARS-CoV Nulceocapsid蛋白的小鼠中和i.v.路线。然后收集气道和肺中的细胞，如实验程序中所述进行染色和收集，并使用Flowjo软件进行分析。 A.气道中的CD4 ⁺ T细胞：CD4 ^{+ CD45} CD90.2 。 B.实质中的CD4 + T细胞：CD4 + T细胞CD45细胞。脉管系统中的CD4 + sup细胞：CD4 +/CD40 + CD90 +。数据代表10个独立实验。（Zhao等人，2016）

笔记

CD45和CD90由所有CD4 + T细胞表达。 CD45和CD90抗体均可用于染色肺和循环中的CD4 + T细胞。优选选择藻红蛋白（PE），APC，BV（或其衍生物） - 共轭抗体，因为这些分子具有大的分子量，其将在体内标记期间最小化气道/血管渗漏。
确保将胶带穿在塑料干燥器格栅的中心孔上，因为小鼠有时能够挤压穿过该孔并跳入底部，填充异氟烷的室。
在这里，我们使用已经用表达SARS-CoV核衣壳蛋白的构建体免疫的抗原经验的小鼠（Zhao等人，2016）。该方案可用于研究小鼠肺中的记忆和效应物以及幼稚的CD4 ⁺ T细胞。
细胞还可以用其他表型（表面）抗体染色，或如前所述（Fett等人，2014））培养细胞内细胞因子染色。
对于表型染色，细胞将重新悬浮于FACS缓冲液中。对于细胞内染色，细胞将在完整的RPMI 1640培养基中重新配制
良好的灌注后，肺的外表面会变白。通常，5ml PBS是足够的。
该步骤是必要的，以防止流式细胞仪中的凝块形成。其他流式细胞仪，如LSR，Fortessa ...也可用于获取细胞。

食谱

Avertin（250毫升）
5g 2,2,2-三溴乙醇
5ml 2-甲基-2-丁醇
225毫升热纳米纯水（95℃）
在通风柜中搅拌2小时，并将体积调节至250 ml
0.2μm过滤器，等分并储存于-20°C
完成RPMI 1640培养基（500 ml）
417毫升RPMI 1640培养基 12.5 ml 1 M HEPES
5 ml 100x L-谷氨酰胺
50ml FBS
5 ml 100x MEM非必需氨基酸
5 ml 100x丙酮酸钠
5 ml 100x青霉素/链霉素
0.5ml 2-巯基乙醇（50mM，在纳米纯H 2 O 2中，0.2μm过滤）
储存于4°C
消化缓冲液（100ml）
100毫克胶原酶D
10毫克DNase I
2 ml FBS
1 ml 100x谷氨酰胺
2.5 ml HEPES（1 M）
1 ml 100x青霉素/链霉素
使用HBSS将体积调整至100 ml 等分并储存于-20°C
FACS缓冲液（500 ml） 1.7ml叠氮化钠（由纳米纯H 2 O制备的30％原料）
15 ml FBS
483.3 ml DPBS
储存于4°C
ACK裂解缓冲液
1克KHCO 3
8.3g NH 4 Cl
37.2mg EDTA-Na 2
用纳米纯H 2 O调节体积至1000毫升，并通过0.2微米过滤器过滤在室温下存放

致谢

这项工作得到了"中国2015年千人计划奖"（J.Z.），广州市卫生联合创新重大项目（201604020011）（J.Z.）和N.I.H.的支持。（USA）（PO1 AI060699，S.P.）。本文所述的方案基于以下手稿：Zhao等人。免疫。 2016年6月21日44（6）：1379-91。

参考文献

Anderson，KG，Sung，H.，Skon，CN，Lefrancois，L.，Deisinger，A.，Vezys，V.and Masopust，D。（2012）。切割边缘：血管内染色重新定义肺CD8 T细胞反应。 J Immunol 189 （6）：2702-2706。
Fett，C.，Zhao，J.and Perlman，S。（2014）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27390762"目标="_ blank">小鼠肺中CD8和CD4T细胞反应的测量。 4（6）。
Zhao，J.，Zhao，J.，Mangalam，AK，Channappanavar，R.，Fett，C.，Meyerholz，DK，Agnihothram，S.，Baric，RS，David，CS和Perlman，S。（2016） ; 气道记忆CD4 ⁺ T细胞调解对新出现的呼吸道冠状病毒的保护性免疫。免疫性 44（6）：1379-1391。