材料和试剂

1. 一次性巴斯德移液器（5.75 英寸硼硅玻璃，非无菌；Fisherbrand，目录号：13-678-20A）

2. 带 PTFE 盖的 Kimble 透明玻璃螺纹样品瓶（Fisher，目录号：03-340-60A [4 ml，17 × 60 mm]；03-340-60C [12 ml，19 × 65 mm]）

3. Mininert ^TM注射器阀、用于螺帽小瓶的密封 PTFE 封闭件和允许 Hamilton 注射器访问的阀打开/关闭动作确保只有 PTFE 和玻璃与溶解在非极性溶剂混合物中的脂质样品溶液接触 [例如，氯仿/甲醇 (2:1) 或己烷/异丙醇/水 (7:3:0.25)]

4. 锥形 V 底小瓶（透明玻璃，Reacti-Vial ^TM1 ml 容量；Thermo Scientific，目录号：13221）

5. 玻璃注射器，气密，各种体积（Hamilton，目录号：1702 [25 µl]；1705 [50 µl]；1710 [100 µl]；1725 [250 µl]；1750 [500 µl]；1001 [10,00 µl] )

6. 1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱（POPC）（Avanti Polar Lipids，Croda Intl.，目录号：850457）

7. 二己酰基磷脂酰胆碱（DHPC）（Avanti Polar Lipids，Croda Intl.，目录号：850305）

8. 己烷，HPLC 级（Fisher Chemical，目录号：H302-4）

9. 异丙醇，HPLC 级（Fisher Chemical，目录号：A451-4）

10. 氯仿，用 0.75% EtOH 稳定（Mallinckrodt，目录号：4440-08）

11. 甲醇（Fisher Chemical，目录号：A412-4）

12. 氮气

13. Cahn 式铝微量天平称重盘（制造商＃120627）（Thomas Scientific，目录号：1162D64）

设备

1. 100 毫升烧杯

2. 配备气压调节器的氮气罐

3. 实验室支撑架 (8.3” × 5.5”) 带杆 (19.7”)、实验室支架夹固定器和 3 爪手指式夹子，用于固定废弃玻璃巴斯德移液器与带有 Tygon 管的N ₂罐相连，用于蒸发有机溶剂在实验室排气罩中使用 N ₂气体采集脂质样品 (< 2 ml) 。

注意：N-EVAP ^TM分析蒸发器（Organomation，111 型或 112 型 24 槽系统）在需要使用 N ₂气从几个小体积 (< 2 ml) 脂质样品中同时蒸发有机溶剂时非常有用。

4. 实验室化学排烟罩，例如，Supreme Air (Keewaunee Sci. Corp.)

5. 旋转蒸发器（Buchi R-300 Rotavapor 型号 11R300152V002）（Fisher Scientific，目录号：05-000-485）[如果脂质溶解在大量溶剂中（例如，> 5-10 ml）则需要]

6. Duo-Seal 真空泵（Welch，型号：1400B-01）；产生 ~0.001 Torr 的真空，抽速为 25 L/min

7. 涡流精灵 2 (Daigger Scientific)

8. 巴斯超声波仪（Branson，2200 型或 22-4 型）

9. KIMAX 玻璃真空干燥器，15 cm 板尺寸（Cole Parmer，目录号：EW-06536-11）

10. Ohaus Analytical Plus 微量天平（精密称重天平，型号 AP250D）

程序

注意：步骤 1 到 6 描述了正确处理脂质以准备使用双细胞脂质混合物稀释生产单层双层囊泡的一般方法。

1. 脂质（从 Avanti Polar Lipids 获得，以干冰运输）储存在 -85°C 直至使用。

注意：-85°C 温度最适合长期储存，以避免含有不饱和度的脂质氧化。对于日常短期使用，-20°C 储存就足够了。

2. 将总脂质含量（通常为 25 或 100 毫克）从 Avanti 玻璃安瓿转移到 Kimble 玻璃螺纹样品瓶中，这些样品瓶之前已经用己烷/异丙醇 (7:3) 或氯仿/甲醇 (2:1) 冲洗过，然后在 N ₂气流下干燥_。

笔记：

a. 用于处理脂质的溶剂应为 HPLC 级质量。

b. 出于健康和安全原因，非氯化溶剂混合物如己烷/异丙醇/水 (7:3:0.25) 是溶解脂质的首选。

c. 不建议使用塑料储存容器（例如，塑料血清管；Eppendorf 管^®等）盛放溶剂中的脂质溶液，因为随着时间的推移，有机溶剂会从塑料中提取材料并污染脂质。为避免此类问题，溶解在有机溶剂中的脂质应储存在清洁的玻璃螺纹瓶中，螺纹用 PTFE 胶带密封，螺帽含有 PTFE 内衬，或者更好的是，用 Mininert ^TM注射器阀密封（参见以下）。

3. 使用温和的 N ₂流从化学排气烟罩中的玻璃螺纹瓶中蒸发溶剂。

a. 在排气罩中放置一个实验室支撑架 (8.3” × 5.5”)，其中包含一根金属棒 (19.7”) 和两个 3 爪手指式夹子（由实验室支架夹固定器固定）。

b. 夹住小瓶，使其下半部分浸入装有室温水的 100 毫升烧杯中。

c. 在含有脂质 + 溶剂的螺旋盖小瓶上方夹住一次性玻璃巴斯德吸管。

d. 用 Tygon ^®管将一次性玻璃巴斯德吸管连接到 N ₂罐。将巴斯德移液器对准螺旋盖小瓶上方，然后将其降低，使移液器尖端保持在含有溶解脂质的溶剂上方。

e. 通过用温和的 N ₂气流吹扫样品来蒸发溶剂。将螺旋盖小瓶的下半部分浸入装有室温水的烧杯中不是必需的，但会通过抵消从玻璃小瓶中去除溶剂的蒸发冷却效果来减少溶剂蒸发时间。

f. 要去除所有残留溶剂的痕迹，请将含有脂质的小瓶放入重型干燥器罐中，并在真空中放置 2 小时。

4. 使用干净的汉密尔顿注射器将所需量的溶剂混合物 (己烷/异丙醇/水 [7:3:0.25]) 添加到含有干脂质的小瓶中。

笔记：

a. 典型的工作储备脂质溶液 (~10 毫克/毫升) 将需要 25 毫克的干脂质等分试样, 然后溶解在 2.5 毫升的溶剂混合物中。

b. 在己烷/异丙醇溶剂中加入微量 H ₂O 有助于确保极性脂质（如磷酸甘油酯和鞘糖脂）的溶解度

5. 使用 PTFE 内衬螺旋盖密封小瓶，以避免橡胶内衬盖中存在潜在污染物。更好的是，使用 Mininert ^TM注射器阀进行密封，以便通过 Hamilton 注射器轻松进入，以避免溶剂蒸发，从而改变脂质库存浓度。

注意：不要使用带有塑料吸头的Pipetman ^®型移液器来分装溶解在有机溶剂中的脂质。分配体积根据水的表面张力进行校准，浸出的塑料会污染脂质样品。

6. 用以下两种方法之一确定储存瓶中的脂质浓度：

a. 使用 Hamilton 气密注射器，将原液的等分试样存放在干燥、预先称重的铝微量天平称重盘（Cahn 型，25 毫米）上。通过升温至 60°C 15-30 分钟和/或置于真空下完全干燥，并立即使用分析微量天平称重三份样品（Ali等，1991）。这种方法的一个变体是 Tejera-Garcia等人的方法。(2012)。

b. 或者，通过磷酸盐的化学分析来量化磷酸甘油酯的库存浓度 (Bartlett, 1959)。Tejera-Garcia等人讨论了相关问题。(2012)。

笔记：

i. 具有短饱和链的 PC（例如 DHPC）具有吸湿性。

ii. 为避免在冷藏期间会改变脂质浓度的溶剂蒸发，可以通过用 PTFE 胶带包裹瓶盖/瓶螺纹接头，然后用封口膜条包裹瓶盖玻璃瓶接头来进一步密封含有脂质原料的小瓶。

iii. 当储存在冰箱中的有机溶剂中时，大多数脂质会从溶液中沉淀出来。然而，当恢复到室温时，脂质会在 30-40℃ 水。

7. 从 0.5 q 值的 POPC/DHPC 库存 bicelle 混合物制备 POPC 单层双层囊泡，如下所示：

a. 将 POPC (0.4 µmol) 和 DHPC (0.8 µmol) 混合在一个透明的玻璃锥形 V 底小瓶中。

b. 在温和的 N ₂气流下蒸发溶剂。

c. 按照步骤 3 所述进行真空处理。

d. 通过在室温下添加 200 µl 缓冲液来水合脂质混合物，以产生 6 mM 总磷脂的浓度（等于 0.3335 wt% [w/v]）。

e. 剧烈涡旋 5 分钟以达到光学清晰度并在室温下孵育过夜。

f. 对于 5x POPC 囊泡浓度，将 POPC (2 µmol) 和 DHPC (4 µmol) 混合在一个透明的锥形 V 型玻璃瓶中。

g. 执行步骤 bd。

h. 通过在室温下加入 200 µl 缓冲液来水合脂质混合物，以产生 30 mM 总脂质的浓度（等于 1.6675 wt% [w/v]）。

i. 剧烈涡旋 5 分钟以达到光学清晰度并在室温下孵育过夜。

笔记：

i. 此处使用的缓冲液是生理离子强度 (145 mM NaCl) 的磷酸盐缓冲盐水 (pH 7.2)。其他极端条件，例如高离子强度（例如 1.5 M NaCl），可能会影响某些两亲物的临界胶束浓度（例如 Chattopadhyay 和 Harikumar，1996 年；Palladino 和 Ragone，2011 年），尚未进行分析。

ii. 涡旋后，如果需要，短暂地超声浴以达到澄清。

iii. 图 2 描绘了响应于 0.5 q 值 POPC/DHPC bicelle 脂质混合物遇到的稀释条件而发生的结构转变。为简单起见，未显示过渡中间结构（例如，由聚结形成的较大的双细胞圆盘和在边缘闭合之前形成的杯状半囊泡中间体）。

iv. 冷冻电镜分析证实POPC单层囊泡的从高度稀释（<125倍）0.5 q中的自发形成-值POPC / DHPC bicelle混合物（见数据分析，图3）。

v. 使用由高度稀释的 0.5 q 值 POPC/DHPC 双胞胎混合物形成的 POPC 单层双层囊泡观察到测量蛋白质介导的脂质膜间转移的最佳结果，通过 Förster 共振能量转移使用荧光脂质（Gao 等人，2020 年）进行跟踪与类似稀释的 0.1、1.0 和 2.0 q 值 POPC/DHPC 混合物相比。

图 3. Cryo-EM 分析显示了由高度稀释的 POPC/DHPC bicelle 混合物形成的 POPC 囊泡的大小、均匀性和单层性质。

A. 冷冻电镜显示 POPC 单层双层囊泡 (31.5 ±3.8 nm 外径）由 0.5 q 值的 POPC/DHPC bicelle 混合物（6 mM；0.335 wt% [w/v]）在室温下保持过夜。条形图显示囊泡大小分布。B. 冷冻电镜显示 POPC 单层双层囊泡（36.3 ± 6.1 nm 外径）由 0.5 q 值的 POPC/DHPC bicelle 混合物（30 mM；1.67 wt% [w/v]）在室温下保持过夜。条形图描绘了囊泡大小的分布（改编自 Gao等人，2020）。

8. 如果需要由高度稀释的 0.5 q 值 POPC/DHPC 双细胞混合物形成的更稀浓度的 POPC 单层双层囊泡，只需在室温下添加并混合所需量的水性缓冲液（Gao等，2020）。

注：如 Gao 等人所述。(2020)，bicelle 混合稀释囊泡的“保质期”在稳定性和存储容量方面非常好。在囊泡间脂质转移测定中，经过冻融或在室温下保持长达 6 天的 bicelle 混合稀释囊泡对脂质转移动力学没有负面影响。

数据分析

如前所述（Gao等人，2020 年），使用在 300kV 下运行并配备 Falcon 3EC 直接电子检测器（Thermo Fisher Scientific）的 Titan Krios 电子显微镜收集 Cryo-EM 数据。通过将 4 μl 磷脂酰胆碱悬浮液样品施加到辉光放电的 Quantifoil Cu R1.2/1.3 网格（电子显微镜科学）来制备冷冻 EM 样品。在室温和 95% 湿度下将网格印迹 4 秒，并使用 Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) 在液态乙烷中快速冷冻。显微照片电影以计数模式记录，使用 EPU 自动数据收集软件，标称放大率为 96,000 倍，对应于 0.895 埃的校准像素大小。POPC 囊泡的单双层（单层）性质是通过观察冷冻电镜显微照片来确定的。POPC 囊泡均匀性基于直径测量。囊泡大小的标准误差是根据 ~200 个囊泡的直径计算的。

笔记

1. 我们的发现与 Katsaras 及其同事的研究一致，他们调查了促进 DMPC/DMPG/DHPC 双细胞混合物形成单层双层囊泡 (ULV) 的条件（Nieh等，2004、2005、2009 和 2011；Harroun等，2005）；Yue等人，2005 年；Mahabir等人，2014 年）。他们的相图表明，如果温度 >35°C 且脂质浓度 <1.25 wt%，则 ULV 可能存在。当充分加热时，低温单分散双细胞可以形成低多分散性 ULV，以进行 DMPC (24°C) 的凝胶到液晶 (Lα) 相变。值得注意的是，在 > DMPC 相变温度的温度下稀释高浓度脂质混合物会导致多分散 ULV。此外，需要 DMPG 的最佳电荷密度，以避免产生 ULV 和多层囊泡的混合物。与此相反，我们的方法中，低得多的POPC液晶（Lα）相转变温度（-2℃），和12 -折叠POPC（0.5 nM）的低临界双层浓度对DMPC（6毫米）似乎是能够在室温下更简单、更直接地生成均质 POPC ULV 的因素。

2. 此处报告的协议也可用于评估蛋白质对脂质囊泡的结合亲和力。在用于比较野生型胞质磷脂酶 A2α C2 域和各种点突变体与 PC 模型膜结合的荧光共振能量转移研究中（Hirano等人，2019 年），POPC/DHPC bicelle 混合物稀释度与那些几乎相同在步骤 7a-e 中描述，并用于脂质转移测定研究（Gao等，2020）中报告的“供体”囊泡形成，与 POPC 单层双层囊泡形成一致。

3. 有关将当前协议应用于 POPC 单层双层囊泡生产的好处的更多详细信息，读者请参阅 Gao等人。(2020)。当需要基于磷酸甘油酯的单层双层囊泡作为分析组件时，该方法的简单性可用于高通量分析。

食谱

在程序部分的步骤 7 和 8 中提供了有关用于从 0.5 q 值 POPC/DHPC bicelle 混合物生成小的、稳定、均质的单层 POPC 双层囊泡的成分和制备条件的精确细节。

致谢

我们感谢美国国立卫生研究院通过 HL125353 和 GM45928 以及荷美尔基金会的支持。此处详述的方法最初在 Gao等人中进行了总结。(2020)。肛门化学92(4)：3417-3425。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

当前的研究不涉及人类或动物受试者的使用或参与。

参考

1. Akbarzadeh, A., Rezaei-Sadabady, R., Davaran, S., Joo, SW, Zarghami, N., Hanifehpour, Y., Samiei, M., Kouhi, M. 和 Nejati-Koshki, K. (2013) . 脂质体：分类、制备和应用。 纳米级 Res Lett 8(1): 102。

2. Ajeeshkumar, KK, Aneesh, PA, Raju, N., Suseela, M., Ravishankar, CN 和 Benjakul, S. (2021)。脂质体技术的进步：食品、功能性食品和生物活性递送的制备技术和应用：综述。Compr Rev Food Sci Food Saf 20(2): 1280-1306。

3. Ali, S.、Brockman, HL 和 Brown, RE (1991)。半乳糖神经酰胺和磷脂酰胆碱表面膜中混溶性的结构决定因素：半乳糖神经酰胺酰基链中不饱和度的影响。生物化学30(47)：11198-11205。

4. 巴特利特，GR (1959)。柱色谱中的磷测定。J Biol Chem 234(3): 466-468。

5. Beaugrand, M.、Arnold, AA、Hénin, J.、Warschawski, DE、Williamson, PT 和 Marcotte, I. (2014)。使用各向同性双细胞的脂质浓度和摩尔比边界。朗缪尔30(21)：6162-6170。

6. Chattopadhyay, A. 和 Harikumar, KG (1996)。两性离子洗涤剂的临界胶束浓度对离子强度的依赖性：对受体增溶的影响。FEBS Lett 391(1-2): 199-202。

7. Chng,CP (2013)。通过粗粒度分子动力学模拟研究模拟温度对磷脂双层-囊泡转变的影响。 软物质9(30)：7294-7301。

8. Fromherz, P. (1983)。脂质囊泡结构：边缘活性剂的大小控制。化学物理快报94（3）：259-266。

9. Gao, YG, My Le, LT, Zhai, X., Boldyrev, IA, Mishra, SK, Tischer, A., Murayama, T., Nishida, A., Molotkovsky, JG, Alam, A.等。(2020)。使用 Bicelle-稀释模型膜测量脂质转移蛋白活性。肛门化学92(4)：3417-3425。

10. Harroun, TA, Koslowsky, M., Nieh, MP, de Lannoy, CF, Raghunathan, VA 和 Katsaras, J. (2005)。由 DMPC 和 DHPC 混合物形成的中间相的综合检查。朗缪尔21（12）：5356-5361。

11. Huang, C.、Quinn, D.、Sadovsky, Y.、Suresh, S. 和 Hsia, KJ（2017 年）。自组装囊泡的形成和大小分布。Proc Natl Acad Sci USA 114(11): 2910-2915。

12. Hirano, Y., Gao, YG, Stephenson, DJ, Vu, NT, Malinina, L., Simanshu, DK, Chalfant, CE, Patel, DJ 和 Brown, RE (2019)。胞质磷脂酶 A2α 的 C2 域识别磷脂酰胆碱的结构基础。电子生活8：e44760。

13. Keller, H.、Worch, R. 和 Schwille, P.（2013 年）。模拟膜系统。 分子生物学方法1008：417-438。

14. Lichtenberg, D. 和 Barenholz, Y. (1988)。脂质体：制备、表征和保存。方法 Biochem Anal 33：337-462。

15. Lu, Z.、Van Horn, WD、Chen, J.、Mathew, S.、Zent, R. 和 Sanders, CR (2012)。Bicelles 低浓度。 Mol Pharm 9（4）：752-761。

16. Laouini, A.、Jaafar-Maalej, C.、Limayem-Blouza, I.、Sfar, S.、Charcosset, C. 和 Fessi, H.（2012 年）。脂质体的制备、表征和应用：最新技术。J Colloid Sci Biotech 1(2): 147-168。

17. 马林克，SJ 和马克，AE（2003 年）。小磷脂囊泡的形成、结构和动力学的分子动力学模拟。J Am Chem Soc 125(49): 15233-15242。

18. Mahabir, S.、Small, D.、Li, M.、Wan, W.、Kučerka, N.、Littrell, K.、Katsaras, J. 和 Nieh, MP (2013)。基于脂质的纳米圆盘到单层囊泡的生长动力学——时间分辨小角中子散射 (SANS) 研究。Biochim Biophys Acta 1828(3): 1025-1035。

19. Manni, MM, Tiberti, ML, Pagnotta, S., Barelli, H., Gautier, R. 和 Antonny, B. (2018)。脑磷脂的酰基链不对称性和多不饱和性促进膜囊泡形成而不会渗漏。电子生活7：e34394。

20. Maja, L.、Eljko, K. 和 Mateja, P.（2020 年）。脂质体制备的可持续技术。J Supercrit 流体165：104984。

21. Nieh, MP, Harroun, TA, Raghunathan, VA, Glinka, CJ 和 Katsaras, J. (2004)。自发形成的单分散仿生单层囊泡：电荷、稀释和时间的影响。 生物物理学杂志86(4)：2615-2629。

22. Nieh, MP, Raghunathan, VA, Kline, SR, Harroun, TA, Huang, CY, Pence, J. 和 Katsaras, J. (2005)。自发形成具有路径依赖性大小分布的单层囊泡。朗缪尔21（15）：6656-6661。

23. Nieh, MP, Kucerka, N. 和 Katsaras, J. (2009)。自发形成单层囊泡。方法 Enzymol 465：3-20。

24. Nieh, MP, Dolinar, P., Kucerka, N., Kline, SR, Debeer-Schmitt, LM, Littrell, KC 和 Katsaras, J. (2011)。从亚稳态纳米盘形成动力学捕获的纳米级单层囊泡。 朗缪尔27(23)：14308-14316。

25. Nkanga, C.、Bapolisi, A.、Ikemefuna, N. 和 Rui, K.（2019 年）。脂质体的一般认知：形成、制造和应用。在：脂质体 - 进展和前景。Catala, A. (Ed.)。DOI：10.5772/intechopen.84255。

26. Palladino, P. 和 Ragone, R. (2011)。离子强度对离子和非离子表面活性剂临界胶束浓度的影响：结合模型。朗缪尔27：14065-14070。

27. Patil, YP 和 Jadhav, S. (2014)。脂质体制备的新方法。化学物理脂质177：8-18。

28. Sanders, CR, 2nd 和 Schwonek, JP (1992)。通过固态 NMR 表征二己酰磷脂酰胆碱和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱混合物中的磁性可定向双层。 生物化学31(37)：8898-8905。

29. Sanders, CR 和 Prosser, RS (1998)。Bicelles：适用于所有季节的模型膜系统？结构6(10)：1227-1234。

30. Tejera-Garcia, R.、Connell, L.、Shaw, WA 和 Kinnunen, PK (2012)。磷脂浓度的重量测定。化学物理脂质165(6): 689-695。

31. Yu, B., Huang, CY, Nieh, MP, Glinka, CJ 和 Katsaras, J. (2005)。来自自发性囊泡的高度稳定的磷脂单层囊泡：DLS 和 SANS 研究。J Phys Chem B 109(1): 609-616。