材料和试剂

带盖玻璃底的共聚焦成像室/35mm 培养皿（Cellvis，目录号：D35-20-1-N）

10 cm塑料培养皿（Greiner，目录号：633185）
1 ml注射器（Becton Dickinson，目录号：309659）
3 ml塑料移液管（Leiwo，目录号：B089FD9Q17）
玻璃毛细管（1 mm × 90 mm）（Narishige，目录号：G-1）
细尖镊子（Fine Science Tools，目录号：11295-51）
Cell-Tak 组织粘合剂（Corning，目录号：354240）
Tg ( ins:Rcamp1.07 ) 斑马鱼胚胎 (24hpf-5dpf)
Tricaine（Sigma-Aldrich，目录号：A5040）
PTU（Sigma-Aldrich，目录号：P7629）
超纯琼脂糖（Invitrogen，目录号：16500100）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
CaCl 2 ·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
1 M Tris-HCl pH 9.0（BIO BASIC，目录号：SD8146）
1× E3 培养基（见食谱）
1,000× PTU 原液（0.2 M）（见配方）
20×三卡因原液（4 g/L）（见配方）
40 mM D-葡萄糖原液（见配方）
1 M D-葡萄糖原液（见配方）
1% 超纯琼脂糖（见配方）

设备

奥林巴斯旋转圆盘共聚焦显微镜（奥林巴斯，目录号：IX83P2ZF ）

自制双光子光片显微镜（2P3A-DSLM；有关如何设计和开发这种显微镜装置的更多信息，请参阅Zong等人，2015 年的原始文章中的详细信息）
奥林巴斯荧光显微镜（奥林巴斯，型号：BX50，目录号：18342 ）
恒温培养箱（Memmert，目录号：HPP110eco）
微波炉
加热块（Bechmark Scientific，目录号：BSH-1001 ）
pH计（Mettler-Toledo，目录号：30266626）
秤（梅特勒-托利多，目录号：ML54 ）

软件

MetaMorph（分子设备，https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy#gref）

HCImage（滨松，https: //hcimage.com ）
斐济/ImageJ（国立卫生研究院，https://imagej.net/Fiji/Downloads）
GraphPad Prism 6.0 或以上版本（GraphPad 软件，https ://www.graphpad.com ）

程序

使用旋转圆盘共聚焦显微镜对斑马鱼胚胎中胰腺 β 细胞的钙活性进行体内成像

准备斑马鱼胚胎

前一天下午设置男女大人。通常，交配池中的一只雄性和三只雌性就足够了。
第二天早上在装有大约 25 ml E3 培养基的培养皿中收集胚胎，并使用大口径塑料移液管丢弃任何未受精或死亡的胚胎。
在受精后 24 小时 (hpf)，在荧光显微镜下检查荧光并选择Tg ( ins:Rcamp1.07 ) 斑马鱼的Rcamp1.07 阳性胚胎。将阳性胚胎转移到装有大约25 ml含有 1 × PTU的 E3 培养基的新培养皿中。更换含有 1 × PTU的 E3 培养基并每天丢弃任何死胚胎。

注意：在 E3 培养基中补充 PTU 有助于减少色素沉着，从而提高成像质量。不需要每天更换培养基，但我们建议每天更新 E3 培养基，尤其是在孵化的前 2 天，因为未受精和发育异常的胚胎在 48 hpf 之前很常见。可以在定型显微镜下进行更仔细的检查。

在对早期胚胎（例如12-36 hpf 胚胎）进行成像时，使用两个细尖的镊子从它们的绒毛膜中解剖出胚胎。具体来说，用一把镊子夹住绒毛膜，并用另一只镊子在绒毛膜上撕开。然后将绒毛膜固定在与撕裂相反的区域，通过将绒毛膜和胚胎穿过其他镊子的尖端之间，轻轻地将胚胎推过开口。或者，许多大于 48 hpf 的胚胎可能已经自发孵化。在这种情况下，不需要 dechorionation 从绒毛膜膜中解剖出胚胎。

注意：镊子的尖端很锋利并且它们的末端可以接触是至关重要的。早期胚胎特别脆弱，因此必须非常小心以尽量减少损坏。

涂层共聚焦成像室和安装斑马鱼胚胎

涂覆每个Cellvis共焦成像室用2-3微升的在玻璃盖玻片底的中心区域单元格德组织粘合剂。使用移液器吸头涂抹 Cell-Tak 组织粘合剂并使其干燥，直至形成非常薄的涂层。

注意：干燥 Cell-Tak 组织粘合剂大约需要 5-10 分钟，我们建议立即使用涂层室。

选择一个胚胎并将其定位在成像室的涂层区域，胚胎体的右侧面向室的底部。这减少了物镜和胚胎胰岛之间的实际距离（图 1A ）。
立即用 200 μl含有 1 × 三卡因的 E3 培养基填充成像室，确保胚胎被完全覆盖（图 1B ）。

图 1. 斑马鱼胚胎安装方法和旋转盘共焦成像设置的说明。

A. 顶视图显示了安装斑马鱼胚胎的方法。B. 侧视图显示了用于对活斑马鱼胚胎中的钙活动进行成像的旋转圆盘共聚焦设置。

使用旋转圆盘共聚焦显微镜对斑马鱼胚胎中 β 细胞的动态钙活性成像

找到斑马鱼胚胎并在最佳焦平面上用最多的胰岛 β 细胞微调到图像 Rcamp1.07 信号。
使用 561 nm 激光在配备 10 × /0.4 NA 物镜的旋转圆盘共聚焦显微镜下照射 Rcamp1.07 信号，并使用 1.6 ×前置放大器放大图像。
使用含有 1 × 三卡因的E3 培养基进行 10-15 分钟的基础钙活性。轻轻地将等体积 (200 μl ) 的 40 mM D-葡萄糖原液添加到成像室中，以在刺激过程中达到 20 mM 的最终浓度。20-40 分钟的刺激钙活动图像（图 2 ）。
对于延时成像，在旋转圆盘共聚焦显微镜下使用 561 nm 激光以 100 毫秒的曝光时间每秒捕获一次图像（1Hz）（图 2 ）。
使用 MetaMorph 软件收集所有延时图像。使用斐济软件处理和分析原始图像数据（有关详细信息，请参阅数据分析）。

图 2.在旋转圆盘共聚焦显微镜下观察Tg ( ins:Rcamp1.07 ) 胚胎中β 细胞的葡萄糖刺激钙活性。

A. 72 hpf 在基础条件下（由蒙太奇图片第一行中的前两个图像指示）和 20 mM 葡萄糖刺激后活 Tg ( ins:Rcamp1.07 ) 胚胎中胰岛钙活性的代表性图像（由蒙太奇图片的剩余图像表示）。箭头（红色和蓝色）表示两个活性区域，显示来自主要胰岛的葡萄糖刺激钙活性。使用MetaMorph 软件捕获延时图像，使用Fiji 软件生成蒙太奇图片。B. (A) 中标记的区域中钙活性的代表性时间过程痕迹。使用GraphPad Prism 6.0软件分析和生成图形。比例尺：20 μm。

使用双光子光片显微镜对活斑马鱼胚胎中胰腺 β 细胞的钙活性进行体内成像

将斑马鱼胚胎转移到琼脂糖上

加热一等分 (1 ml) 的 1% 琼脂糖，并在设置为 38-40 °C的加热块中保温。
将三卡因添加到琼脂糖中，使其终浓度为 1 倍，并轻轻混合。
选择Tg ( ins:Rcamp1.07 ) 斑马鱼的一个去绒毛膜 Rcamp1.07 阳性胚胎，并使用塑料移液管将其转移到温暖的 1% 超纯琼脂糖中（视频 1-2）。

注意：在转移胚胎进行琼脂糖镶嵌时，不可避免地要随胚胎一起携带额外的 E3 培养基。额外的 E3 培养基，如果体积很大，会改变琼脂糖溶液的最终浓度，因此，它可能会导致琼脂糖胚胎安装不均匀。在此步骤中转移尽可能少的额外 E3 培养基。

视频 1. 斑马鱼胚胎移植。

视频 2. 琼脂糖安装策略。

将斑马鱼胚胎安装在琼脂糖缸中

在拿起斑马鱼胚胎之前，使用注射器连接的玻璃毛细管 (图 3A )用 1% 琼脂糖溶液填充自行设计的安装装置。
通过非常轻轻地拉动注射器来取出胚胎，并将胚胎的头部指向毛细管的开口端。

注意：避免在毛细管内产生气泡。

保持毛细管水平，直到琼脂糖完全凝固（图 3A ）。
部分插入含有斑马鱼胚胎的短琼脂糖圆柱体，使用光片显微镜 4D 阶段配备的装置支架将其垂直定位（图 3B-3C ），并将琼脂糖嵌入的胚胎浸入光片立方体中成像室预装了 49 ml 含有 1 × 三卡因的 E3 培养基。

注意：作者发现在琼脂糖圆柱体而不是玻璃毛细管中照射斑马鱼胚胎将大大提高信噪比并增强图像对比度。

旋转装置支架以将嵌入的胚胎定向，胚胎体的右侧面向光片显微镜的照明目标。这允许光穿透斑马鱼胚胎和更有效的 Rcamp1.07 信号照明（视频 1-2）。

图 3. 斑马鱼胚胎安装方法和 2P3A-DSLM 双光子光片显微镜成像设置的说明。

A. 一种自行设计的安装装置，由一个与玻璃毛细管相连的注射器组成。公元前。为了提高图像质量，部分插入含有斑马鱼胚胎的短琼脂糖圆柱体，并使用光片显微镜 4D 阶段配备的设备支架将其垂直定位。

使用 2P3A-DSLM 对斑马鱼胚胎中 β 细胞的动态钙活性成像

找到斑马鱼胚胎并微调 4D 阶段，将 Rcamp1.07 阳性胰岛 β 细胞置于最佳焦平面上。
使用 1030 nm 激光在配备两个 40 × /0.8 NA 水透镜或具有类似参数的双光子光片设置的2P3A-DSLM 下照亮 Rcamp1.07 信号。
在含有 1 × 三卡因的E3 培养基中捕获延时图像以记录基础钙活性。将 1 ml 的 1 M D-葡萄糖原液添加到立方成像室中，以在刺激过程中达到 20 mM 的最终浓度。在高葡萄糖 E3 介质下捕获延时图像以记录受刺激的钙活动（图 4 ）。

注意：根据具体的实验设计和研究兴趣，刺激时间可能会有所不同。在大多数情况下，需要在葡萄糖刺激下记录 15-60 分钟的延时图像。这允许鱼胚胎渗透和吸收葡萄糖以及捕获对 β 细胞葡萄糖刺激的钙反应所需的时间。

图 4. 2P3A- DSLM下Tg ( ins:Rcamp1.07 ) 胚胎中β 细胞的葡萄糖刺激钙活性的可视化。

A.静息状态下 β 细胞中 Rcamp1.07 荧光的可见性代表细胞内钙的基础水平。B. 在 20 mM 葡萄糖刺激下 Rcamp1.07 的荧光强度显着增加将葡萄糖反应性 β 细胞（标记为 1、2、3 和 4）与葡萄糖非反应性 β 细胞（标记为 5 和6). 比例尺：10 μm。

对于 2D 延时成像实验，将胰岛光学切片为 5-6 个平面（z 步长 = 10 μm ）。使用 2P3A-DSLM 下的 1030 nm 激光或类似的双光子光片设置和成像程序，以 150-200 毫秒的曝光时间捕获每个平面（Mahou等人，2014 年）。使用这种策略，对整个胰岛进行成像，每个成像周期需要 1.5-2 秒（图 4 ）。
对于整个胰岛内钙活动的快速体积成像实验和重建，将胰岛光学切片为 25 个平面（z 步长 = 2 μm ）。捕获每个平面五次，每次曝光时间为 8 毫秒，平均为一张图像。

注意：此平均过程将通过增加信噪比来大大增加图像对比度）。使用这种策略，每个成像周期对整个胰岛进行成像大约需要 1 秒（25 × 5 × 8 毫秒 = 1 秒）（参见我们原始 eLife 研究文章中的视频 3、5 和 6 [ Zhao et al., 2019] ） .

使用 HCImage 软件收集所有延时图像，并使用斐济软件处理原始图像数据（详情见数据分析）。

数据分析

对于图像处理和分析，请使用斐济或 ImageJ 软件。

对于背景减法，打开斐济/ImageJ 加载图像处理减去背景在 Rcamp1.07 通道中滚动球半径 80（图 5A）。
去除相机引起的噪点，打开Fiji/ImageJ 加载图像处理噪点去除异常值半径：2 个像素；阈值：80；哪些异常值：明亮（图 5B）。
对于3D渲染，打开Fiji/ImageJ  load stack images  Image  Stack  3D-projection 投影方式：Brightest Point；旋转轴：Y轴；切片间距英寸（取决于 z 步长）选中插值框（图 5C）。
对于长期延时成像期间的图像漂移校正，打开斐济/ImageJ 加载堆栈图像插件注册 StackReg 转换：刚体（图 5D）。
统计分析使用GraphPad Prism 6.0或以上版本软件。执行未配对学生的双尾t检验以比较两个指定组和单向方差分析之间的数据，通过 Dunnett 检验与对照组进行多重比较。

图 5. 使用 Fiji 或 ImageJ 软件的图像处理方法的说明。

AD：每个步骤的快照描述了背景减法 (A)、移除异常值 (B)、3D 渲染 (C) 和图像漂移校正 (D)。

食谱

1× E3 中号

5 毫米氯化钠

0.17 毫米氯化钾

0.33 mM CaCl 2 ·2H 2 O

0.33 mM MgSO 4 ·7H 2 O

将 20 ml 50× 原液加入 1 L 容器中，并用 MilliQ 水填充至 1 L。

1,000× PTU 原液 (0.2 M)

将 30.44 g PTU 添加到 1 L 乙醇中，并储存在密封瓶中。

20× 三卡因原液 (4 g/L)

将 4 g 加入 Tricaine 的 979 ml 1× E3 培养基中，然后加入 21 ml 1 M Tris-HCl (pH 9.0) 将 pH 调节至 7.0。

40 mM D-葡萄糖原液

将 7.2064 g D-葡萄糖加入 1 L 1×E3 培养基中，用 0.22 μm 过滤器灭菌，4°C 保存。

1 M D-葡萄糖原液

将 18.016 g D-葡萄糖加入 100 ml 1×E3 培养基中，用 0.22 μm 过滤器灭菌，4°C 保存。

1% 超纯琼脂糖

将1g琼脂糖加入100ml 1×E3培养基中，微波炉加热至琼脂糖完全融化，溶液完全澄清。

将 1 ml 温热的琼脂糖溶液分装到 1.5 ml 离心管中，并在 -20°C 下储存。

致谢

本工作得到国家科技重大专项（2016YFA0500400）、国家自然科学基金（91854112、91750203、31327901、31521062、31570839、3810301）、北京市自然科学基金（31570839、3810301）的支持和资助. 该协议首先在我们的原始研究论文中描述，“体内β 细胞功能成像揭示了葡萄糖介导的 β 细胞功能发育的异质性”发表在eLife (Zhao et al. , 2019; doi:10.7554/eLife.41540 ）。

利益争夺

作者声明没有潜在的利益冲突。

伦理

动物护理、转基因斑马鱼系的产生和所有动物实验均获得中国北京大学 IACUC 的批准（参考编号：IMM-ChenLY-2）。

参考

Huang, H.、Vogel, SS、Liu, N.、Melton, DA 和 Lin, S. (2001)。活转基因斑马鱼胚胎胰腺发育的分析。Mol 细胞内分泌177(1-2): 117-124。
Mahou, P.、Vermot, J.、Beaurepaire, E. 和 Supatto, W.（2014 年）。多色双光子光片显微镜。Nat 方法11(6): 600-601。
Pagliuca, FW, Millman, JR, Gurtler, M., Segel, M., Van Dervort, A., Ryu, JH, Peterson, QP, Greiner, D. 和 Melton, DA (2014)。体外产生功能性人胰腺β细胞。单元格159(2)：428-439。
Rezania, A., Bruin, JE, Arora, P., Rubin, A., Batushansky, I., Asadi, A., O'Dwyer, S., Quiskamp, N., Mojibian, M., Albrecht, T. ，等。(2014)。用人多能干细胞体外衍生的胰岛素生成细胞逆转糖尿病。Nat Biotechnol 32(11): 1121-1133。

Zhao, J., Zong, W., Zhao, Y., Gou, D., Liang, S., Shen, J., Wu, Y., Zheng, X., Wu, R., Wang, X.,等人。(2019)。β 细胞功能的体内成像揭示了葡萄糖介导的 β 细胞功能发育的异质性。eLife 8：e41540。
Zong, W., Zhao, J., Chen, X., Lin, Y., Ren, H., Zhang, Y., Fan, M., Zhou, Z., Cheng, H., Sun, Y. 和Chen, L. (2015)。大视场高分辨率双光子数字扫描光片显微镜。细胞研究25(2): 254-257。