材料和试剂

手术刀和手术刀片（Securelab，24 号）
70 µm 细胞过滤器（Falcon，目录号，目录号：352350）
40 µm 细胞过滤器（Falcon，目录号，目录号：352340）
100 mm 组织培养皿（Falcon，目录号：430167）
35 mm 组织培养皿（Falcon，目录号：353001）
60 mm 组织培养皿（Falcon，目录号：353002）
50 ml 聚丙烯离心管（Falcon，目录号：352098）
10 ml血清移液管（Falcon，目录号：357551）
解剖板（泡沫聚苯乙烯板）
盖玻片 24 × 50（Menzel，目录号：15737592）
移液器吸头 (Corning)
封口膜（Sigma，目录号：P7793 ）
4-6 周龄的 WT C57BL/6J 小鼠（杰克逊实验室）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5671）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
用于免疫染色的疏水性 PAP 笔（Sigma-Aldrich，目录号：Z377821 ）
人肌肉活组织检查[即，从接受手术的患者获得的臀大肌活组织检查；贝内代蒂等人。(2021)]
Vectashield 安装介质（Vector Laboratories，目录号：H-1000-10）
Hoechst 33342染色染料（Abcam，目录号：ab228551 ）
一抗：

Pax7（发展研究杂交瘤银行）

MyoD（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-760）

MyoG (F5D)（发育研究杂交瘤银行）

MyHC (MF20)（发育研究杂交瘤银行）

荧光标记的二抗：

山羊抗兔 Alexa Fluor 488（1:1,000，Abcam，目录号：150077）

山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555（1:1,000，Thermo Fisher Scientific，目录号：A28180）

0.1% 明胶（Stem Cell Technologies，目录号：07903）
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：59202C）
鸡胚提取物（Seralab，目录号：CE-650-J）
山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
马血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：26050088）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442），在 56°C 下热灭活 30 分钟
含有MgCl 2和 CaCl 2 的Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（PBS），不含MgCl 2和 CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
青霉素-链霉素（pen/strep）溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P0781）
庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
4％甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：1004968350）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
II型胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C6885 ）
胶原酶/分散酶（Roche，目录号：11097113001 ）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：51976）
70% 乙醇（见配方）
II型胶原酶消化溶液（见食谱）
胶原酶/分散酶消化溶液（见食谱）
生长培养基（见食谱）
分化培养基（见食谱）
中和缓冲液（见配方）
Hoechst 解决方案（见食谱）

设备

显微手术剪刀（Fine Science Tool，目录号：14184-09）
显微手术镊子（Fine Science Tool，目录号：11252-00）
移液器 (Gilson, P10, 20, 200, 1000)
加湿室（通过用蒸馏水润湿纸巾并将其放入带盖的塑料容器中制备）
离心机（Eppendorf，型号：5702）
立式高压釜（Falc ，型号：ATV80）
调温振荡水浴（GLS，目录号：1083）
生物安全柜（Gelaire，型号：BSB4 A）
实验室化学通风柜（ESCO，Frontier Acela）
CO 2培养箱 Thermo Forma（Thermo Fisher Scientific，型号：3110）
蔡司 Axioskop 2 Plus 显微镜（卡尔蔡司）
相差显微镜（Nikon Eclipse，型号：TS100）
用于血清移液器的移液器控制器 (Falcon)
血球计数室 Neubauer 改进型（BLAUBRAND，型号：BR717810 ）
制冰机

软件

ZEISS ZEN 2 Blue edition (Carl Zeiss)（从https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software.html 下载）
ImageJ 1.53a（从https://imagej.nih.gov/ij/download.html下载）

程序

肌肉卫星细胞的分离

笔记：

只有在获得伦理批准后才能进行实验程序。
对小鼠和人体肌肉执行相同的程序。

小鼠卫星细胞的分离

第 1 天：肌肉解剖前的准备工作

准备 70% 乙醇（见配方）。
高压灭菌器解剖仪器（剪刀和镊子）。
将 3 ml 补充有 1% pen/strep 的 DMEM 添加到 60 mm 细胞培养皿中（每克人类肌肉活检一盘/小鼠或一盘）。这些将用于收集解剖肌肉。
涂上 0.1% 明胶的细胞培养皿：

分别用 1 ml 和 5 ml 0.1% 明胶涂覆 35 mm 和 100 mm 细胞培养皿，确保培养皿的整个表面均匀涂覆，并在 37°C 5% 的细胞培养箱中孵育 30 分钟一氧化碳2 。接下来，去除多余的明胶（不洗盘子），将盘子打开，在引擎盖下风干 10-15 分钟。这些培养皿将用于细胞培养。

注意：隔离后一天将需要 35 毫米培养皿。

制备 II 型胶原酶和胶原酶/分散酶消化溶液（参见食谱）。
准备酶中和缓冲液（参见食谱）。
准备细胞生长培养基（见食谱）。
准备细胞分化培养基（见食谱）。
消毒手术刀和手术刀片。
在 37°C 下预热水浴。
1. 第 1 天：解剖小鼠后肢肌肉

有关解剖过程的示意图，请参见图 2。

图 2. 解剖小鼠股四头肌、胫前肌和腓肠肌。

安乐死一只老鼠 [即，通过颈椎脱位；贝内代蒂等人。(2021)]。
将鼠标固定在解剖板上，并用 70% 乙醇喷洒。
使用解剖剪刀，在脚踝上方的皮肤上做一个切口，然后在后肢的整个长度上剥离皮肤，露出下面的肌肉。
从双腿收集胫骨前肌、股四头肌和腓肠肌 (图 2)。
将解剖的肌肉放在含有 DMEM 的 60 毫米盘子中，并辅以 1% 笔/链球菌，并去除任何头发以最大程度地减少污染风险。
将菜肴转移到生物安全柜下，并使用无菌手术刀将肌肉切成 1 毫米的碎片（图 1b）。

注意：从解剖肌肉中取出并丢弃任何脂肪。

将切碎的肌肉转移到 50 ml 管中，并在室温 (RT) 下以 300 × g离心5 分钟。

第 1 天：肌肉消化 I（图 1c）。

用 10 ml 血清移液管吸出上清液，并将切碎的肌肉重新悬浮在每克组织10 ml的 II 型胶原酶消化溶液中（参见食谱）。

注意：使用移液器去除上清液很重要，因为在这一步中沉淀不稳定。

用封口膜密封管子并将它们转移到摇晃 (100 rpm) 预热 (37°C) 水浴中 45 分钟。

注意：水平放置管子，使它们完全浸没在水中。

用 70% 乙醇喷洒管并将它们转移到生物安全柜。
通过每克组织添加 10 ml 酶中和缓冲液来阻断消化酶（参见食谱）。
用 10 ml 血清移液管上下吸管五次。
在室温下以 300 × g离心5 分钟。

第 1 天：肌肉消化 II（图 1d）。

用 10 ml 血清移液管吸出上清液，并将沉淀重悬在每克组织10 ml胶原酶/分散酶消化溶液中（参见食谱）。
用封口膜密封管子，并将它们转移到摇晃 (100 rpm) 预热 (37°C) 水浴（如步骤 A3b）中 30 分钟。
用 70% 乙醇喷洒管并将它们转移到生物安全柜。
通过每克组织添加 10 ml 酶中和缓冲液来阻止消化（参见食谱）。
用 10 ml 血清移液管上下吸管五次。
通过 70 µm 细胞过滤器将消化的肌肉筛入新的 50 ml 管中。
通过 40 µm 细胞过滤器将消化的肌肉筛入新的 50 ml 管中。

注意：充分消化的肌肉将很容易通过过滤器。如有必要，肌肉消化物可以再次通过另一个过滤器，以去除大部分细胞碎片和未消化的肌肉。

在室温下以 300 × g 的速度将肌肉消化管离心5 分钟。
弃去上清液，将沉淀重悬在 10 ml DMEM 10% FBS 中。使用台盼蓝计算肌肉单核细胞的数量。

注意：在此步骤中，如果使用了 1 只以上的鼠标，您可以合并颗粒。平均而言，3、4-8 周龄小鼠消化后释放的细胞数量约为 10 7 个细胞。

第 1 天：预镀步骤（图 1e-1f）。

将细胞以 10 5 /ml接种在100 毫米培养皿（未包被）中，置于 20 毫升 DMEM 10% FBS 1% 笔/链球菌中，并在 37°C 下孵育 1 小时。
将未粘附的细胞收集在 50 ml 管中，并在室温下以 300 × g离心5 分钟。
丢弃上清液并在 DMEM 10% FBS 1% pen/strep 中重新悬浮细胞颗粒。
对重悬的细胞进行计数，并以 10 5 /ml 的浓度将它们接种到 100 毫米的培养皿（未包被）中，放入20 毫升的 DMEM 10% FBS 1% pen/strep 溶液中。将细胞在 37°C 下孵育 1 小时（如步骤 A5a）。
收集并转移未粘附的细胞到 50 ml 管中。

注意：平均而言，预镀步骤会去除约 50% 的强贴壁细胞，例如成纤维细胞。

在 RT 下以 300 x g将带有非粘附细胞的管子离心5 分钟。
丢弃上清液并将细胞沉淀重悬在生长培养基中（参见食谱）。
将细胞以 10 6 个细胞/盘放入0.1%明胶涂层的100毫米盘中。一夜之间种植它们（图 1g）。

第 2 天：冰冷处理 (ICT)（图 1h）。

在室温下用 10 ml PBS（含MgCl 2和 CaCl 2 ）清洗含有粘附肌肉细胞异质混合物的菜肴三次。

注意：轻轻地在盘子周围吸取 PBS。

向每个 100 毫米的培养皿中加入 10 毫升冰冷的 PBS（不含MgCl 2和 CaCl 2 ）。

注意：可以使用含或不含 CaCl 2 的PBS 。然而，使用不含 CaCl 2 的PBS会促进分离。

用冰块 (0°C) 填充聚苯乙烯盒，将盘子放在冰上 15-30 分钟，偶尔轻轻手动摇动盘子（产生旋转运动）。

笔记：

如果纯度是最重要的（例如，99-100% 纯度），则盘子在冰上的放置时间不应超过 30 分钟。尽管如此，培养皿可以在冰上放置长达 1 小时以提高细胞产量，纯度仍高达 90%。
含有异质肌肉细胞的原始菜肴（从隔离程序的第 1 天开始）可以保留至培养的第 3 天，并用于进一步的 ICT 轮次。

将分离的细胞收集到 50 ml 管中。
用 10 ml PBS 再次清洗原始培养皿以收集剩余的分离细胞。

注意：轻轻地在盘子周围吸取 PBS。

在室温下以 300 x g离心细胞5 分钟。
丢弃上清液并将细胞重新悬浮在生长培养基中。
计数细胞。

注意：在原始培养皿培养 24 小时后，在冰上放置 30 分钟后，平均可以收集1.5 × 10 4 -2 × 10 4 SCs。在培养 48 小时或 72 小时的第二次或第三次 ICT 后，可以进一步收集4 × 10 4 SCs。

将细胞板放入预涂有 0 的 35 毫米盘子中。1% 明胶，密度为 10 3细胞/培养皿，并将它们放入细胞培养箱中。

注意：在此密度下，SC 最多可增殖三天。之后，他们开始分化。增加电镀密度将加快成肌细胞分化和融合成肌管所需的时间。

细胞培养

在生长培养基中培养细胞，每两天更换一次培养基。
为了诱导成肌细胞分化，一旦细胞达到 80% 汇合，去除生长培养基并用分化培养基替换它（参见食谱）。

细胞传代

将含有增殖 SCs 的菜肴放在冰上长达 30 分钟。
按照 A6 中描述的步骤进行操作。

人肌肉卫星细胞的分离

笔记：

只有在获得伦理批准和知情同意后才能进行使用人体肌肉活检的实验程序。
从人类肌肉活检中获得的 SCs 数量可能因供体的年龄而异，通常从老年供体那里获得的细胞数量较少。

肌肉解剖前的准备

按照步骤 A1 进行操作。

肌肉切割

将人体肌肉活检组织放入含有 DMEM 的 60 毫米盘中，并辅以 1% 笔/链球菌。在生物安全柜中工作。
使用剪刀去除任何脂肪和结缔组织。
使用无菌手术刀将肌肉切成 1 毫米的碎片。
将切碎的肌肉转移到 50 ml 管中，并以 300 × g离心5 分钟。

肌肉消化I：

按照 A3 中的说明进行操作。

肌肉消化二：

按照 A4 中的说明进行操作。

注：平均而言，消化 1 g 人体肌肉活检组织可获得2 × 10 6肌肉单核细胞。

预镀：

按照 A5 中的步骤进行。

信息通信技术：

按照 A6 中的步骤进行。

为了在分离后的第 1 天进一步丰富 SCs 异质肌肉细胞培养物，可能需要在进行 ICT 之前将其再生长 3-4 天（当培养物达到约 80% 的汇合度时）。

笔记：

在第一次 ICT 之后，平均可以收集1 × 10 4 个SC。
在培养 48 小时或 72 小时的第二次或第三次 ICT 后，可以再收集2 × 10 4 SCs。

细胞培养

按照步骤 A7 进行操作。

注意：人类 SCs 的增殖速度比小鼠 SCs 慢，倍增时间为 46 小时。

免疫荧光染色分析小鼠和人卫星细胞特异性标志物的表达

在 35 毫米培养皿中培养细胞。
吸出培养基并用 1 ml PBS 和MgCl 2和 CaCl 2洗盘子一次。
通过添加 4% PFA（1 ml/35 mm 培养皿）固定细胞并在室温下孵育 10 分钟。

注意：PFA 是有毒的，必须在化学通风柜下使用。

将 PFA 丢弃到有毒废物容器中，用 1 ml PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
加入冷甲醇（1 ml/35 mm 培养皿）使细胞通透，并在 -20°C 下孵育6 分钟。
将甲醇倒入有毒废物容器中，用 1 ml PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
取出 PBS 并用疏水笔标记盘子的边界。
在 RT 中加入含有 5% 山羊血清（100 μl/35 mm 培养皿）的 PBS 封闭 30 分钟。
去除封闭液，用适当稀释度的一抗（100 μl/35 mm 培养皿）孵育细胞 [Pax7 (1:10)、MyoD (1:50)、Myogenin (1:20) 和 Myosin Heavy Chain (1:20) 稀释在无菌过滤的 4% BSA/PBS] 中，在 4°C 的加湿室中过夜。
去除一抗溶液，用 1 ml PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
用二抗（100 μl/35 mm 培养皿）[山羊抗兔 Alexa Fluor 488 (1:1,000) 和山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 (1:1,000) 用无菌过滤的 1% BSA/PBS 稀释细胞孵育细胞] 在室温下，在黑暗中的腐殖室中放置 1 小时。
去除二抗溶液，用 1 ml PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
用 Hoechst 溶液（见食谱）（100 μl/35 mm 培养皿）在室温下在黑暗中复染细胞核 5 分钟。
取出 Hoechst 溶液，用 1 ml PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
使用 Vectashield 安装介质（30 μl/35 mm 培养皿）安装盖玻片。
在荧光显微镜下分析。

数据分析

在明场显微镜下分析细胞形态（图 3A 和 4A）。为了分析 Pax7、MyoD、Myogenin 和 Myosin Heavy Chain (MHC) 等生肌标志物的表达，按照程序部分的描述对细胞进行染色（图 3B 和 3D）。ICT 隔离后，小鼠 SC 纯度高于 99%。SC 纯度通过 Pax7 和 MyoD 的免疫荧光染色评估，通过计算 ICT 后在生长培养基中培养第 3 天 Pax7 和/或 MyoD 呈阳性的 SCs 的百分比（图 3B 和 3C）（Benedetti等，2021）。

使用 ICT 方法分离的人类 SCs 的纯度在 ICT 后通常高于 97%。因为培养中的人类 SCs 迅速下调 Pax7 的表达，SC 纯度通过肌细胞生成素的免疫荧光染色评估，通过计算生长培养基中培养第 5 天的肌细胞生成素阳性 SCs 的百分比（图 4B 和 4C）（Benedetti等人。 , 2021)。通过使用抗肌球蛋白重链 (MHC) 抗体进行免疫荧光染色来分析人类 SCs 的分化潜能（图 4D）。

图 3. 使用 ICT 方法对小鼠肌肉 SCs 进行分离和表征。

A.小鼠肌肉细胞培养的代表性明场图像。SCs 通过 ICT 从异质单核细胞中分离出来。ICT 隔离的 SCs 在第 2 天 (D2) 和第 4 天 (D4) 在生长培养基 (GM) 中以及在添加分化培养基 (DM) 后的第 3 天 (D3)。B.针对 Pax7（红色）、MyoD（绿色）和细胞核（蓝色）染色的 ICT 隔离 SCs 的代表性免疫荧光图像。C.图表显示了在 ICT 后在生长培养基中培养的第 3 天 Pax7 和/或 MyoD 阳性细胞的百分比（n = 3 个独立实验）。D.在生长培养基中四天后在 DM 中染色三天后，ICT 分离的 SCs 的代表性免疫荧光图像被染色为肌球蛋白重链 (MHC)（红色）和细胞核（蓝色）。比例尺 = 100 μ米。误差棒代表平均值 ± SEM (Benedetti et al ., 2021)。

图 4. 使用 ICT 方法分离和表征人类肌肉 SCs (hSCs)。

A.在第 3 天 (D3) 和第 10 天 (D10) 在生长培养基 (GM) 中以及在添加分化培养基 (DM) 后的第 10 天，异质人肌肉单核细胞培养物和分离的 SCs 的代表性明场图像。B.针对肌细胞生成素（红色）和细胞核（蓝色）染色的人类 SCs 的代表性免疫荧光图像。C.图显示了在 GM 中培养第 5 天 ICT 后肌细胞生成素 + 细胞的百分比（n = 3 个独立实验）。D.在GM 中10 天后，在 DM 中 10 天后，针对肌球蛋白重链 (MHC)（红色）和细胞核（蓝色）染色的人类 SC 的代表性免疫荧光图像。比例尺 = 100 µm。误差棒代表平均值 ± SEM (Benedetti et al ., 2021)。

食谱

70%乙醇

将 70 ml 100% 乙醇加入 30 ml ddH 2 O

在室温下储存

II型胶原酶消化液

将 II 型胶原酶粉末溶解在含有 MgCl 2和 CaCl 2 的PBS 中，浓度为 0.4 毫克/毫升，每克组织总共溶解10 毫升。

胶原酶/分散酶消化液

将胶原酶/分散酶粉末溶解在 PBS MgCl 2和 CaCl 2 中，浓度为 1 毫克/毫升，每克组织总共需要 10 毫升。

生长培养基

用 20% 马血清、3%鸡胚提取物、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺补充 DMEM 培养基。储存在 4°C。

分化培养基

用 5% 马血清、1%鸡胚提取物、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺补充 DMEM 培养基。储存在 4°C。

中和缓冲液

用 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素补充 DMEM 培养基。

赫斯特解决方案

在 PBS 中以 1:1,000稀释 Hoechst 染色剂

致谢

这项工作得到了荷兰杜兴父项目 NL (DPP NL) 对 BLO 的资助；意大利父项目（PP，意大利）对 MB 和罗马大学的研究资助（RP11715C7D238352、RM118164275C7EBE 和 RM11916B7E20311C 到 MB，以及 AR11715C7F9E158E、AR1181516186E 到 AB ）。该协议描述了 Benedetti等人发表的工作。(2021)。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的财务或非财务利益。

伦理

所有涉及小鼠的程序均经意大利卫生部批准，并根据欧盟法规和意大利动物研究法进行。伦理批准 ID：82945.19。有效期至 18/01/2023。

所有患者均知情同意接受术中肌肉活检并公布获得的临床和实验室数据。

参考

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Benedetti, A.、Cera, G.、De Meo, D.、Villani, C.、Bouche, M. 和 Lozanoska-Ochser, B.（2021 年）。基于冰冷处理的纯卫星细胞分离和长期扩增的新方法。骨骼肌11(1)：7。
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