材料和试剂

1. 10 ml 离心管 (HOUDIOR)

2. 1.5 ml 离心管（Axygen）

3. 刀片（吉列蓝、超级吉列蓝刀片，4.3 cm × 2.2 cm）

4. 培养皿（直径 90 毫米）

5.玻璃底培养皿（In Vitro Scientific，目录号：D35-10-1.5-N）

6. 过滤器，400 目（BIODEE，目录号：DE2009）

7.纤维素酶“ONOZUKA”R-10（Yakult，目录号：L0012-10g）

8. Macerozyme R-10（Yakult，目录号：L0021-5g）

9.果胶酶Y-23（Yakult，产品代理（BIODEE）目录号：AOV0094-1g）

10. MES（Sigma-Aldrich，目录号：M3671-50G）

11. PEG4000（Sigma-Aldrich，目录号：81240-1KG）

12. D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021-100G）

13. β-硫甘醇（Amresco，目录号：0482-100 ml）

14. BSA（Amresco，目录号：0332-100g）

15. D-甘露醇（BIODEE，目录号：BN20023-250g）

16. KCl（BIODEE，目录号：DE-0395A-250g）

17. NaCl（BIODEE，目录号：DE0008-500g）

18. MgCl 2 ·6H 2 O（BIODEE，目录号：DE-0288A-500g）

19. CaCl 2（BIODEE，目录号：DE-0556A-500g）

20. 质粒（溶于双蒸水，2 µg/µl）

21. 酶溶液（见配方）（表 1）

22. W5 解决方案（见配方）（表 2）

23. MMg 溶液（见配方）（表 3）

24. PEG/Ca 2+溶液（见配方）（表 4）

25. D-甘露醇溶液（见配方）

设备

1. 1,000 µl 微量移液器 (Eppendorf)

2. 200 µl 微量移液器 (Eppendorf)

3. 10 ul 微量移液器 (Eppendorf)

4. 细胞计数板（MARIENFELD，型号：MARIENFELD-0650030）

5. 锥形瓶（Bomex，50 毫升，500 毫升）

6. 植物培养箱（Percival，型号：AR-36L3）

7. 细菌摇床培养箱（Crystal Technology & Industries，型号：IS-AX-190L）

8. 离心机（Eppendorf，型号：5804 R）

9. 共聚焦显微镜（Carl Zeiss，型号：Zeiss LSM780）

程序

A.绒毛松材料和溶液的制备

1. 1 个月大的毛绒毛松幼株在组织培养基中生长。茎片段在芽繁殖培养基 [Murashige 和 Skoog (MS) 培养基上培养，含有 0.1mg/L α-萘乙酸 (NAA), 0.02 mg/l 噻二唑脲 (TDZ)] 30 天以获得小苗，然后将小植株转移到生根培养基（1/2 强度 MS，含有 0.05 mg/L NAA）具有 16/8 小时（亮/暗）光周期。30 天后，幼苗长约 10 厘米高度（图 1）。

图1.毛毛松制备及转染实验方案叶肉原生质体。

将在组织培养基上生长的 1 个月大的P. tomentosa植物的叶子切成 1 毫米在 0.8 M D-甘露醇中预处理 20 分钟的条带。将叶条在酶溶液中消化 3-5 h，然后用400目细胞过滤器过滤，离心并用W5溶液洗涤原生质体两次，然后用 MMg 缓冲液洗涤两次。含有 10 μl 的转染反应质粒、MMg 重悬原生质体 (100 μl) 和 40% PEG/Ca 2+溶液 (110 μl)50 分钟。用 W5 溶液洗涤并孵育 12-16 小时。离心并观察使用玻璃底培养皿转染原生质体。

2. 制备酶、W5、MMg 和 PEG/Ca 2+溶液。将 W5 和 MMg 溶液置于使用前 4°C 至少1 小时。

B. P. tomentosa原生质体的分离

1. 制备 D-甘露醇溶液（见配方）。

2. 用锋利的刀片将 5 片毛茸茸幼叶切成 1 毫米宽的条状，完全将它们浸入 D-甘露醇溶液中，并将培养皿放在工作台上（房间温度，23°C) 20 分钟。

3. 将叶条转移到装有准备好的酶溶液的 10 ml 离心管中，放置将试管水平置于细菌摇床培养箱中避光，10 rpm 摇晃3-5 h23°C 直至溶液颜色变为绿色。

4. 用 400 目细胞过滤器过滤，将滤液转移到新的 10 ml 离心管中，并在 23°C 下以 100 × g离心2 分钟。去除上清液并保留 2 ml 沉淀物。

C. 质粒转染

1. 沿管壁轻轻加入 2 ml 预冷的 W5 溶液以洗涤原生质体，轻轻地倒置混匀，4°C 100 × g离心1 分钟，去除上清液。

2. 重复 C1 一次。

3. 用 2 ml 预冷的 W5 溶液重悬原生质体并置于冰上 30 分钟。

4.在 4°C 下以 100 × g离心1 分钟并去除上清液。

5. 加入 2 ml 预冷的 MMg 溶液重悬原生质体，100 × g离心1 分钟4°C，除去上清液。

6. 将原生质体重悬至 1 × 10 5 -5 × 10 5每毫升（用细胞测定它们的密度）计数板）与预冷的 MMg 溶液，并使用切割的微量移液器尖端（0.5-1 厘米）添加每个基因转染质粒需要 100 µl 原生质体悬浮液。

7. 在 23°C 下处理以下步骤。将目标基因的 10 µl 质粒 (2 µg/µl) 添加到 1.5 ml离心管，加入 100 µl 原生质体悬浮液，用微量移液器轻轻混匀。加入 110 µl（等体积）的 PEG/Ca 2+溶液，并用切割的微量移液器吸头轻轻混合（0.5-1 厘米）。

8. 23°C 避光孵育 50 分钟（转染步骤）。

9. 加入 440 µl（两倍体积）的 W5 溶液，用切好的微量移液器吸头（0.5 cm）轻轻混合，23°C 100 × g离心1 分钟，除去上清液。

10. 加入 100 µl W5 溶液，用切好的微量移液器吸头（0.5-1 cm）混合，100 × g离心1 次

在 23°C 下放置 min，并去除上清液。

11. 重复 C10 一次。

12. 加入 1 ml W5 溶液，与 1,000 µl 微量移液管混合，23°C 避光孵育12-16 小时。

13.在 23°C 下以 100 × g离心1 分钟并去除上清液。转移沉淀放在玻璃底培养皿上进行共聚焦显微镜观察（50-80% 的转染效率，图1）。PtHTB9 和 EgHTB9 的转染结果如图 2 和图 3 所示，分别。

图 2. GFP-PtHTB9 在P. tomentosa叶肉原生质体中的转染。

P. tomentosa HTB9 基因 (PtHTB9, Potri.008G030600)的编码序列 (CDS ) 是插入到修饰的 pUC19-GFP 载体中，并使用 10 μl GFP-HTB9 质粒（2 μg/μl）用于转染。图像是用蔡司 780 共聚焦显微镜拍摄的。比例尺 = 50 μm。

图 3. GFP-EgHTB9 在Eucalyptus urophylla × E. grandis叶肉中的转染原生质体。

所述的编码序列（CDS）E.桉HTB9基因（EgHTB9，Eucgr.B03925）为

插入到修饰的 pUC19-GFP 载体中。比例尺 = 50 μm。

笔记

1. 本研究中使用的所有化学品均为分析试剂 (AR) 标准品。

2. 为了获得高转染效率，我们强烈建议使用 PEG4000 (Sigma-Aldrich,目录号：81240-1KG）浓度为 40%。

3. 用剪刀剪掉 C6、C7、C10 的所有 100 µl 微量移液器吸头的吸头（0.5-1 厘米长）和 C11 步骤，并切断 C9 步骤的 1,000 µl 微量移液器吸头的吸头（0.5 厘米长）

4. 可选择在酶溶液（表 1）中加入 β-巯基乙醇。

5. 已灭菌并单独存放的 W5 或 MMg 溶液可在 4°C 下放置 1 年，而酶和 PEG/Ca 2+溶液应在使用前新鲜制备。

6. 将离心的所有加速和减速设置为 5（最大 10）。

7. 在 10 ml 离心管中水平消化的叶子与 10 ml 酶溶液提供更好的隔离。管中空气过多（15 毫升离心管中的 10 毫升酶溶液）步骤 B3 中的更高速度 (>60 rpm) 会导致更多破碎的原生质体。

8. C6 步骤中较小的原生质体浓度提供更高的转染效率，同时更高的悬浮液浓度提供更高的产量（转染细胞）。

食谱

1. 酶解（表 1）

表 1. 酶溶液的配方

库存解决方案 重量或体积 最终浓度

纤维素酶 R-10 0.15 克 1.5%

Macerozyme R-10 0.04 克 0.4%

果胶酶 Y-23 0.05 克 0.5%

D-甘露醇 1.092 克 0.6M

200 毫米氯化钾 1毫升 20 毫米

200 毫米 MES 1毫升 20 毫米

5 ml ddH 2 O，涡旋，55°C 10 分钟，在室温下冷却

1 M 氯化钙2 100 微升 10 毫米

7.5 mM β-硫甘醇 66.67 微升 0.05 毫米

1% BSA 1毫升 0.1%

用 ddH 2 O填充体积至 10 ml

2. W5 解决方案（表 2）

表 2. W5 解决方案的配方

库存解决方案 重量或体积 最终浓度

2 M 氯化钠 38毫升 154 毫米

1 M 氯化钙2 62.5 毫升 125 毫米

200 毫米氯化钾 12.5 毫升 5毫米

200 毫米 MES 5毫升 2毫米

D-葡萄糖 0.45 克 5毫米

用 ddH 2 O填充体积至 500 ml

3. MMg 溶液（表 3）

表 3. MMg 溶液的配方

库存解决方案 重量或体积 最终浓度

D-甘露醇 7.29 克 0.6M

150 mM 氯化镁 10毫升 15 毫米

200 毫米 MES 2毫升 4毫米

用 ddH 2 O填充体积至 100 ml

4. PEG/Ca 2+溶液（表 4）

表 4. PEG/Ca 2+溶液的配方

库存解决方案 重量或体积

PEG4000 3克

ddH 2 O 2.25 毫升

0.8 M D-甘露醇 1.785 毫升

1 M 氯化钙2 0.75 毫升

5. D-甘露醇溶液

将 2.912 克甘露醇溶解在 90 毫米直径培养皿中的 20 毫升 ddH 2 O 中。

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金项目（31900173 to H.-长宽；31970196转ZL；31770649 到 XX）。该协议是从以前的工作（Yoo et阿尔。, 2007; 郭等，2012；谭等人，2013 年；Lin et al ., 2014)，我们要感谢所有促成了这些先前公布的程序。

利益争夺

没有经济、个人或专业利益影响工作。

参考

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