材料和试剂

1.缝合4-0 Ethicon Absorbable plus抗菌剂（Vicryl，目录号：109162）

2. 自攻螺钉（18-8 不锈钢开槽平头螺钉，M0.8 × 0.2 mm 螺纹，2毫米长；McMastercarr，目录号：91430A143）

3. 无菌棉签，棉签头 6"/Sterile 100/box (Dynarex)

4. 刺激针，无菌不锈钢针 24 号（BD，Microlance，目录号：1730738)

5. 动物：Sprague-Dawley 大鼠，雄性，年龄（7-10 周）（Charles River，目录号：400）

6. 32 通道线性探头（Neuronexus，A1x32-6mm-50-177-CM32，15 µm 厚度，Gen4，批次# P994)

7. 氯胺酮 100 mg/ml（Coventrus，目录号：056347361-4）

8. 甲苯噻嗪鸡尾酒，100mg/ml（Sigma-Aldrich，目录号：7361-61-7）

9.异氟烷（Coventrus，目录号：029405）

10.丁丙诺啡，0.03 mg/ml（Coventrus，目录号：059122）

11. Marcaine，0.5%（Coventrus，目录号：054893）

12. 聚维酮碘，10% 局部溶液（CVS，目录号：59779-085）

13. Etch-Gel，磷酸 40%（DMG，目录号：61901）

14. Gel Foam ®（辉瑞，目录号：115631）

15. SeaKem ®琼脂糖（Lonza，目录号：50004）

16. 三重抗生素，0.9 克袋装（25 克拉盒）（Safetec，目录号：53205）

17. 氯胺酮/赛拉嗪鸡尾酒（见食谱）

氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒：

● 对于 1 毫升溶液：0.9 毫升氯胺酮 (100 毫克/毫升) + 0.1 毫升甲苯噻嗪 (100 毫克/毫升)

● KX 大鼠鸡尾酒 0.1 毫升/100 克大鼠重量。IP（氯胺酮：90 毫克/公斤，甲苯噻嗪：9.0 毫克/公斤）

设备

1、多通道采集系统（MCS，无线录音，型号：W2100）

2、多通道记录刺激探头（MCS，headstage，型号：HS32-EXT0.5mA）

3. 戴尔 PC i7，RAM：8Go，SSD：500 GoPremium Silicone

4. Kopf 带操纵臂的啮齿动物立体定向框架

5.电子面包板（半尺寸面包板；63；adafruit.com）

6. 电子电缆（包覆公-公跳线，200 mm × 40；Adafruit.com，目录编号：4482）

7. MCS 同轴 TTL 电缆（C-BNC-Lemo1m；多通道系统附件）

8.电动剃须刀（飞利浦，Norelco oneblade QP2520/90）

9. 电钻和环钻（微电机世阳，H102S）

10. CCI 尖端，直径 3 毫米（定制）

11. CCI冲击机（UGA车间定制）

软件

1. 收购软件：控制系统实验者（多通道系统，https://www.multichannelsystems.com/ )

2.系统配置：控制系统配置文件（多通道系统，https://www.multichannelsystems.com/ )

3. 数据分析：MATLAB+控制系统工具箱（多通道系统，https://www.multichannelsystems.com/ )

4. Matlab R2019b (Mathworks Inc., mathworks.com )

程序

A.系统设置

系统设置被详细描述在图1中描述。

我们使用了两个通过 W2100 同步的电池供电的 HS32-Ext0.5 mA 探头来自多通道系统(MCS)。该系统允许使用单独的理由记录和刺激，限制了 eStim 诱发的伪影（即电伪影）。这HS32的探头可在一个双极电设置刺激而提供同时通过一个 32 通道的记忆连接器进行录音。录音探头已连接到 32 导联线性硅胶探头 (Neuronexus)。为了获得准确的刺激时间，刺激探头连接到动物的爪子并将电压返回到MSC。该系统允许的事件有一个精确的同步刺激和记录神经反应。我们从 2 个区域（按顺序）记录以评估层流爪刺激后大鼠 S1 区和 S1/M1 区的反应。

B. 受控皮质损伤 (CCI) 手术程序和 eCS 凝胶植入物

1. 在 CCI 损伤之前，用 5% 异氟醚麻醉每只动物（切换到维持 2-3%一旦进行了切口——步骤 B4)。

2. 皮下注射丁丙诺啡 (0.3 mg/ml, 0.05 ml/300g, Henry Schein)，

3. 将头皮剃光和消毒（70% 乙醇和 3% 聚维酮碘）的动物放在连接到温控加热垫 (37°C) 的立体定位框架。

4. 进行矢状切口并使用蚀刻凝胶（磷酸蚀刻，亨利施恩）。

5. 使用安装在电钻上的 5 毫米直径环钻进行开颅手术。

6. 将 3 毫米 CCI 尖端安装到气动活塞上，使其与硬脑膜表面接触（完全伸展位置），然后缩回以调整 2 毫米的冲击深度。

7. 启动 3 毫米 CCI 尖端以产生冲击。编程诱发了严重的 CCI 损伤活塞速度达到 2.25 m/s，停留时间为 250 ms，导致初始直径为 3 mm深度为 2 毫米的损伤。

8.在受伤部位涂抹可吸收明胶（Gel Foam ®，辉瑞制药），使用无菌棉签去除多余的血液。

9. 去除明胶，用一层 1% 无菌琼脂糖完全覆盖损伤部位（SeaKem ®，Lonza）。

10.缝合皮瓣在一起以闭合伤口。在缝合采用三层抗生素霜皮肤。

11.可选：对于 eCS 组，eCS 凝胶在 CCI 后 48 小时使用预光交联凝胶通过 32 号 Hamilton 注射器（速度：20 μl/10 分钟）在CCI 病变的中心（1 毫米深）。

C. 电极放置手术程序（CCI 后 8 周）

1. 大脑区域名称见结构命名。

结构名称：

●M1：初级运动皮质

●RFA：喙前肢区域，用于手动控制的M1区域的一部分。

● CFA：前肢尾部区域，用于手和腿控制的 M1 区域的一部分

● S1：初级感觉皮层

● AP/ML/DV：相对于前囟点（参考）的立体定位；AP：前-后部，ML：中外侧，DV：背腹侧

2. 在 CCI 后 8 至 10 周，使用麻醉剂麻醉接受 RFA 靶向病变的大鼠氯胺酮/赛拉嗪混合物（100毫克/千克），并代替立体定位框架上。

3. 在矢状头皮切口后，在损伤尾部进行开颅手术（图 2）（AP：0mm，ML：2 到 4mm，相对于 bregma）。使用带环钻（直径 2 毫米）的牙钻，在头骨内画一个正方形，从受伤部位的一半宽度到前囟（AP：0毫米），具有3-4毫米的宽度，并且覆盖整个横向侧（从中线到颞颅肌）。然后，用细镊子提起并小心取出骨瓣。

4. 进行硬脑膜切开术以插入 32 通道硅胶探头 (Neuronexus)。使用将 1 ml 胰岛素针头弯曲 90° 的尖端切向于大脑，以避免对灰质的任何损害。将针移过开颅手术的长度以撕裂硬脑膜，并在开颅区域外翻转其碎片。

5.将硅酮探针（图3，视频1）在运动区邻近于所述RFA（位置1：CFA，AP：0 毫米，ML：2.5 毫米）或在感觉运动区域（位置 2：S1，AP：0 毫米，ML：3.5毫米）在距离大脑表面 2 毫米的深度处。重要：由于执行了 CCI在RFA，终审法院地区应该保持不变。如果坏死的CFA区域观察，记录可能会产生少量的健康单位尖峰。坏死CFA/S1 区域可以通过液化或褐色组织的存在来识别稠度、组织体积缺失或黑色组织混合凝固和未凝固血液。

6. 使用探针参考（顶部接地电极）作为主要参考，并用螺钉定位左小脑上方（后侧，对侧半球）作为地面。探头参考是描述在这主要的制造商网站：

https://www.neuronexus.com/files/technicalsupportdocuments/Chronic-Wiring- Configurations.pdf （有关内部参考，请参阅长期探针参考描述）。

D. 爪电极放置程序

1. 使用双极配置进行爪子刺激。使用接收器和源的紧密定位电极产生短距离电刺激，从而导致非常局部化组织的电场激发。双极配置与单极配置相反配置，其中接收器和源放置得很远，带有刺激区域结果变得更大，更不具体。

2. 将刺激器的阳极和阴极连接到不锈钢针上。

3. 将两个电极尖端相距 2 mm 插入前肢（手掌）的腹侧部分爪子）。然后，将爪子和整个前臂放在无菌垫上。

E. 记录程序

1. 使用多通道系统 (MCS) W2100 以 20 kHz（单位增益）数字化和记录神经数据采集模块和无线探头（HS32-EXT-0.5 mA，16 位；图 4A）。

2. 对于尖峰分析，通过实时带通 (300-5,000 Hz）并使用基线预先计算的阈值作为触发器来保存尖峰波形和尖峰事件时间戳（阈值：5 个标准差）。不要对单个单元数据进行排序；而是使用多单元峰值作为人口活动的衡量标准（图 4B，视频 2）。

3. 稳定 10 分钟后执行所有记录 5 分钟。

F. 刺激方案

1. 使用单脉冲（双相，相位 1 毫秒）执行所有爪子刺激，间隔为 1 秒。脉冲间隔 (1 Hz)。提供总共 120 个脉冲（2 分钟）的刺激。记录连续 5 分钟，并将刺激设置为在基线 1 分钟后开始并停止 2 分钟在记录结束之前，获得返回到基线期。

2. 选择 50 µA 的刺激强度，因为这会在没有由于电刺激而存在伪影。使用两个独立的电池供电Headstages 对爪子进行刺激并记录电极，允许用于独立接地和低交叉电气伪影形成。

3. 将每个刺激触发共同注册到记录系统以匹配实际交付刺激，而不是刺激的估计开始时间。

数据分析

1. 使用定制的 Matlab ®代码（Mathworks Inc.）和提供的数据分析所有数据多通道系统 matlab 工具箱。根据合理要求，用于分析的脚本可以通过电子邮件共享。

2. 记录一个32通道线性电极的数据，并根据记录的通道分组如图 S11D（abe0207 手稿）或图形所示的层状组织抽象的。对所有录音使用相同的通道分组，考虑到深度（2mm从硬脑膜）和接地位置（电极参考/接地放置在第 1 层）的位置类似（第 1 层：无；第 2/3 层：ch1-3；第 4 层：ch4-10；第 5A 层：ch11-14；第 5B 层：ch15-19；第6A：ch20-29；第 6B 层：ch30-32）。数据分析包括：

a. 刺激触发的直方图：使用 bin 直方图来估计引发的尖峰数量在刺激之后（图 5E；图 S11E 来自 Latchoumane等人，2021 年）。

b. 从平均多单元波形（图 6A），估计尖峰波宽度和峰值 -到谷值以获得细胞类型的分布（即，规则的尖峰单位显示更宽的宽度和更低的振幅；显示较短宽度和较大宽度的快速尖峰单元振幅）。

c. 使用分为前（1 分钟）、STIM（2 分钟）和后（最后 3 分钟）的 5 分钟录音时间min)，估计每层中跨通道的平均发射率。计算 z 分数使用基线期间放电率的平均值和标准差（前一个没有 STIM 或前 STIM 期间的记录）。这个估计可以为每个组 (Sham、TBI、eCS) 和每个位置 (CFA 和 CFA/S1) (图 6B)。

结果

笔记

再现性的重要考虑因素：

1. 接地问题：考虑使用基于电池的单独记录和刺激系统减少记录噪音、电刺激引起的伪影和其他可能影响记录质量的电相互作用。

2. 如果使用多柄硅胶探头（本协议中未描述）：使用可以跨越跨越空间，并在整个录音中插入一次可能是有利的对于这种录音。这将有助于减少总录音时间，并提供参与感觉运动的所有层和相邻皮层区域的同时响应加工。

3.刺激探头的定位：对于每一个硅胶探头录音，使用慢速在插入电极的过程中，以避免剪切损坏。

4. 麻醉深度：在氯胺酮诱导的前 40-60 分钟内进行录音麻醉以获得最稳定的数据。氯胺酮加强后，麻醉水平可能会变得更加可变，从而导致较低的重现性。提供的录音电极本质上是具有单个神经元动作电位的局部场电位 (LFP)，它可以使用 0-300Hz 和 500-3000Hz 带通滤波器滤除。特别是，监测使用皮层区域的 LFP 反应确定麻醉水平，并包括一些 delta-Theta 波（0-4Hz 脑电波）通常在稳定的无意识阶段观察到。定期监测动物对捏尾巴和爪子的反应，以确保动物不会回归意识。此过程应在记录期间执行，使用与多单元录音相同的设置。

致谢

这项工作得到了 LK 的 NIH (RO1NS099596) 奖的支持，并部分得到了一个佐治亚州再生工程和再生医学种子基金的合作伙伴LK 的医学 (REM) 研究中心和再生康复研究联盟和培训 (AR3T) 技术开发补助金给 LK 和 C-FL。原作 (Latchoumane等。, 2021), DOI: 10.1126/sciadv.abe0207。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

伦理

动物的所有程序都得到了机构动物护理和使用委员会的批准(IACUC)。方案是根据护理和使用指南进行的美国国立卫生研究院 (NIH) 发布的实验动物，协议编号 A2020-06-002（2020-2023 年期间）。

参考

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2. Fernández-García, L., Marí-Buyé, N., Barios, JA, Madurga, R., Elices, M., Pérez-Rigueiro, J.,Ramos, M.、Guinea, GV 和 González-Nieto, D. (2016)。丝素蛋白的安全性和耐受性水凝胶植入小鼠大脑。 生物材料学报45：262-275。

3. Hao, P., Duan, H., Hao, F., Chen, L., Sun, M., Fan, KS, Sun, YE, Williams, D., Yang, Z. 和Li, X. (2017)。 NT3-壳聚糖通过增强内源性神经发生进行神经修复成人局灶性吸入脑损伤后。生物材料140：88-102。

4. Latchoumane, CV, Betancur, MI, Simchick, GA, Sun, MK, Forghani, R., Lenear, CE,Ahmed, A.、Mohankumar, R.、Balaji, N.、Mason, HD等。(2021)。工程糖材料植入物在严重后长期协调脑组织的大规模功能修复创伤性脑损伤。Sci Adv 7（10）：eabe0207。

5. Tan, HX, Borgo, MPD, Aguilar, MI, Forsythe, JS, Taylor, JM 和 Crack, PJ (2020)。生物活性基质在创伤性脑损伤再生疗法中的应用。生物材料学报102：1-12。

6. Yang, Z., Zhang, A., Duan, H., Zhang, S., Hao, P., Ye, K., Sun, YE 和 Li, X. (2015)。 NT3-壳聚糖引发强大的内源性神经发生，使脊髓后功能恢复成为可能受伤。 Proc Natl Acad Sci USA 112(43): 13354-13359。