材料和试剂

1.微孔板，96孔板，PS，F-Bottom（烟囱孔）黑色，非结合（Greiner Bio-One，目录号：655900）
2. HEPES（Thermo Scientific，Fischer Bioreagents，目录号：BP-310）
3. KOH（默克，密理博，目录号：1.05033）
4. Nonident-P40（Thermo Fischer Scientific，Fluka，目录号：74358）
5. KCl（Carl Roth，目录号：6781.1 ）
6. MgCl 2 ·6H 2 O（默克，密理博，目录号：7791-18-6）
7. ATP（储存在-20℃）（卡尔罗斯，目录号：K054.3）
8. α酮戊二酸的二钠盐水合物（在4℃存储）（热菲舍尔科学，Fluka公司，目录号：K3752） -另一个名称2 -氧代戊二酸（2-OG）
9.甘氨酸（默克，Sigma-Aldrich，目录号：33226）
10. NiCl 2 ·6H 2 O（Carl Roth，目录号：4489.1）
11.动力学缓冲液（见ř ecipes）

设备

Ni-NTA (NTA) Dip and Read TM生物传感器（托盘）（Sartorius、FortéBio®，目录号：18-5103 ）
FortéBio ® Octet K2 系统（赛多利斯）

软件

数据采集 11.0.0.64
（FortéBio ® ， https : //www.sartorius.com/en/products/protein-analysis/octet-systems-software）
数据分析 HT 11.0.0.50
（FortéBio ® ，https : //www.sartorius.com/en/products/protein-analysis/octet-systems-software ）
Prism，版本 6.01 或更高版本（GraphPad Software Inc.）

程序

对于此协议中，我们使用纯化的6 × His-标记的P II蛋白作为所述诱饵蛋白（配体）和Strep标记PIRC蛋白质（分析物），如先前所描述（Orthwein等人，2021）。它建议使用5-25微克/毫升的每一个96孔的配体-井板时加载的蛋白质到的Ni-NTA生物传感器。如果在测定中使用25 µg/ml，则进行 50 次测量至少需要500 µl 中 0.5 mg/ml 的纯化配体浓度。这提供了具有足够量蛋白质的动力学缓冲液的可接受稀释度。需要高出 5 倍的最小分析物摩尔浓度。
注意：可以将您的蛋白质储存在含有甘油的缓冲液中。
方法概述：通过 6 × His 标签尾部（加载）将配体特异性加载到 Ni-NTA 传感器尖端，然后在动力学缓冲液中进行洗涤步骤。然后将加载的吸头浸入分析物溶液中以测量复合物的形成（缔合），由增加的信号指示。之后，用复合传感器浸入回在所述动力学缓冲液（下降信号的解离）。之前和之后的程序，所述传感器被洗涤并用酸性的10mM甘氨酸溶液（pH 1.7）和10mM的再生的NiCl 2溶液。软件使用关联和解离信号计算平衡响应 (R eq )。R的值当量为每个分析物浓度被绘制在曲线图（R当量针对所述分析物的浓entration ），其用于所述的确定的动力学参数。对于此目的，该测量是用不同浓度的分析物的执行，以确定K个d和不同浓度的所述执行器，以确定该EC 50 。然后根据相关分析物浓度绘制R eq值。对于EC 50测定，值被转换并且相对于分析物的 log 10绘制相对响应。然后，用统计软件动力学分析（例如，被的GraphPad Prism）进行反应动力学参数的计算。

生物层干涉动力学结合测定
使用FortéBio ® Octet K2 系统 (Sartorius)进行测定。
注意：确保用于分析物的其他标签不与聚组氨酸（可能是金属蛋白）相互作用或与 Ni-NTA 非特异性结合。切割去除标签后，可以使用带有 His 标签的蛋白质作为分析物；但是，不建议这样做。通过将分析物试验加载到生物传感器上进行测试。如果有信号，则分析物存在非特异性结合。如果有非特异性结合分析物，建议加载，其余的装配位置一个His标签的蛋白质即与分析物相互作用没有。对于一式三份，测量三次，新制备的96 -孔平板。
开关在机器上和prewarm样品架为一个最小的30分钟。调整选择的工作温度。
注意：由于蓝藻的生长温度，我们使用了 30°C 。
制备动力学缓冲，传感器洗涤液，即，10mM甘氨酸pH值1.7（调节pH值用HCl），和再生溶液，即，10毫的NiCl 2 。
注意：相互作用的最佳条件取决于所研究的蛋白质。可能需要进行初步缓冲液筛选试验（例如，不同的 pH 值和盐分）以确定蛋白质-蛋白质相互作用的最佳条件。我们使用了配方部分中描述的动力学缓冲液。
稀释动力学缓冲液中的配体，用于 Ni-NTA 传感器尖端加载。
注意：配体的最佳浓度应在动力学蛋白质-蛋白质相互作用测定开始之前进行测试。为此，使用不同的配体浓度进行试验加载实验。制造商协议建议配体浓度在 5-25 µg/ml 之间。我们使用浓度不超过的结合信号Δ λ= 5nm以下。
制备系列稀释的7种不同浓度的分析物。
注意：我们recomme ND开始荷兰国际集团的稀释〜10倍的预期ķ d ，如制造商方案中所述。
填充96的小瓶-井用200μl溶液的板，如图图1 。

图1。移液96的方案-井板用于动力学测定。塔4包含从稀释系列的最高（A）至所述分析物的最低浓度（G）。小瓶 4H 包含不含分析物的对照。一个技术说明的Ni-NTA生物传感器的动力学分析-来自制造商的方案dapted （福特生物，2019）。

将您的盘子放入机器中进行预热。
按照顶部菜单在Data Acquisition 11.0.0.64 (Sartorius, FortéBio ® ) 中定义实验并开始测量。
板的定义：d efine所述板位置和在表中输入的附加信息，如图图2 。

图2 。板定义和样品信息表。定义：(1A-H) 缓冲液、(2A-H) 上样、(3A-H) 缓冲液、(4A-H) 样品、(10A-H) 洗涤、(11A-H) 中和和(12A-H) 再生. 浓度是示例值。
注意：使用分析物的浓度和 MW。

测定定义。定义测定如图 3所示。
注意：关联和解离步骤的时间取决于所研究的蛋白质。对于动力学研究，我们建议通过使用介于 2-10 分钟之间的不同结合/解离时间并使用分析物的饱和浓度s （~ 10 ×预期 K D ）进行初步分析来确定最佳结合和解离时间。定义 A 行和 B 行的测定步骤方法。标记测定步骤列表并单击“复制”以克隆其他行的步骤（> 复制 > 复制类型：添加新测定 > 偏移步骤 > 垂直 > 确定）。

图3。分析定义的动态结合试验

传感器分配。在正确的行中分配传感器。
复习实验。回顾你的实验。
运行实验。定义定位，命名结果并开始实验。
注意：如果您之前润湿了生物传感器，请单击“延迟实验开始：600 秒”。这样做一个LSO如果你没有prewarm你以前板块的实验。

欧共体的测定50小效应分子（效应）的那个在干涉的蛋白质-蛋白质复合物
准备一系列稀释的研究效应物。
注意：在示例中，我们使用了 2-OG 代谢物，因为它抑制了 P II -PirC 复合物。为预清洗步骤准备一系列不含分析物的效应物稀释系列（用于填充第 3 列中的孔）和包含分析物的稀释系列（效应物每次稀释中均含有恒定量的分析物）作为分析物结合（用于填充第 4 列中的孔）。分析物的用量应能使配体饱和，如根据先前的动力学数据确定。
填充96的小瓶-井用200μl溶液的板，如图图4 。

图4。吹打方案96的-孔平板用于测定EC的50对效应该影响蛋白质复合物的稳定性。第 3 列和第 4 列分别包含从最高 (A) 到最低浓度 (G) 的效应物稀释系列，分别不含和含有恒定量的分析物。小瓶 4H 包含没有效应器的控制[改编自制造商协议 –技术说明 Ni-NTA 生物传感器动力学分析（FortéBio ，2019 年）] 。

重复步骤A6 和 A7。

数据分析

动力学结合测定
启动数据分析HT 11.0.0.50（赛多利斯，福特生物® ）软件并打开测量结果。
转到预处理数据 > 数据校正并按如下方式调整设置：
Align Axis: Align Data to: Average of Baseline 。
步间校正：将数据对齐到：关联步骤。
激活 Savitky-Golay 过滤。
转到动力学分析并按如下方式调整设置：
分析步骤：关联和解离。
结合模型：取决于蛋白质。
1:1 模型推荐用于蛋白质复合物，其中分析物与配体的一个特定结合位点结合。如果分析物结合在两个独立的配体位点，请使用 2:1（异质配体）模型。质量传输模型推荐的绑定是通过扩散的限制。一种分析物的二价模型拟合的结合是与固定的配体的两个站点进行交互。制造商的用户手册（第 114 页，Pall FortéBio LLC ，Octet 系统数据分析用户指南）中提供了详细信息。
配件。
类型：全球（集团）
分组依据：传感器类型
R最大值：链接
稳态分析：R 平衡。
软件计算在平衡的响应值，并创建你的测量的稳态曲线图，如图图5 。

图5。数据分析软件中的动力学分析页面。曲线图（曲线图拟合）下面的功能选项卡显示经过预处理的数据是如何装配有设置在第3步以下示出所计算出的R本列表当量的值和关于所述传感器的附加信息。在右侧边缘，显示了一个测量行的稳态计算。还报告了计算的 K D 。
注意：您可以使用此计算来确定 K D ，但无法组合多个测量值。

单击“Excel 报告”导出数据。
打开 Prism 并创建一个新的 Table and Graph Project 。
输入和导入数据：
单击 XY。
在并排子列中输入三个重复值。
注意：也可以使用不同的软件来计算和拟合结合动力学。确保软件包含正确的结合动力学方程。
将 R eq值作为 Y 值传输到 GraphPad 表中。
将相互作用物浓度添加为 X 值。
单击自动创建的图形并执行“分析”功能。
非线性回归（曲线拟合）。
绑定 - 饱和度。
一个站点 – 特定绑定。
该软件适合的曲线图，并创建与所计算的乙一个结果文件最大（= R最大）和K d ，如示于图6。

图6 。分析的代表性数据为蛋白质相互作用的动力学分析了在P II -PirC例子。(A) 结合 ( Re eq ) 与分析物浓度 (Strep-PirC) 的拟合。(B)结果文件夹中计算动力学的棱镜文件（结果文件）。该窗口示出了最大结合（B最大），计算出的ķ d ，以及两者的标准误差。还计算置信区间和拟合质量。

EC 50测定
重复数据的步骤一nalysis A1 - A4 。
添加效应浓度作为 X 值。
通过单击“Excel 报告”导出数据，并将 R eq值作为 Y 值传输到 GraphPad 表中。
注意：对于一式三份，用新制备的 96 孔板测量三次。
执行“分析”函数“正常化”与Y = 0.0作为0％和在每个数据设定为100％最大值。
执行“分析”功能“转换”并使用 X = Log[X]转换 X 值。在原始数据表中，将浓度从0改为1。
执行“分析”功能“非线性回归（曲线拟合）”
剂量反应 - 抑制（负效应子；IC 50 ）/剂量反应 - 刺激（正效应子）。
Log(inhibitor) vs. normalized response/Log(agonist) vs. normalized response 。
软件拟合图形并使用计算出的 EC 50创建结果文件。Ť他实例IC 50示于图7。

图7 。代表数据分析测定IC的50 2-OG的在在P II -PirC相互作用。(A) P II -PirC 结合的三次重复测量的拟合数据，用于确定2-OG的IC 50 。2-OG 浓度的 X 轴对数（2 mM、1 mM、0.5 mM、0.25 mM、0.125 mM、0.0625 mM 和 0.03125 mM 的稀释系列）和Y 轴：平衡中的相对响应。(B)结果文件夹中计算的 IC 50 的棱镜文件（结果文件）。该窗口显示对数 IC 50 、计算的 IC 50和两者的对数标准误差。还计算置信区间和拟合质量。

食谱

动力学缓冲液
20 mM HEPES pH 8
150 毫米氯化钾
5 mM Mg 2 Cl
1 毫米三磷酸腺苷
0.005% 不认同 P40
用于调节 pH 值的 KOH

致谢

这项工作由 DFG 向 KF（Fo195/9 ‐ 2，Fo195/21-1）和卓越集群“控制微生物对抗感染”（EXC 2124 – 1-06.010_0）向 KAS 提供资助。此外，我们要感谢Janette Alford 协助撰写初稿，感谢Libera Lo Presti 对手稿进行批判性的科学和语言编辑，以及卓越集群“控制微生物对抗感染”（EXC 2124）的基础设施支持) 德国研究基金会 (DFG)。
该协议基于我们在生物化学杂志上发表的原始研究文章：Santos, ARS, Gerhardt, ECM, Parize, E., Pedrosa, FO, Steffens, MBR, Chubatsu, LS, Souza, EM, Passaglia, LMP, Sant'Anna, FH, de Souza, GA, Huergo, LF 和 Forchhammer, K. (2020)。细菌中的NAD +生物合成通过 PII 信号受全球碳/氮水平控制。J Biol Chem 295(18): 6165-6176。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

KAS 构思并启动了该项目。TO 进行了实验，撰写了初稿并编辑了手稿。LFH、KF 和 KAS 对手稿进行了评论和编辑。所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。

参考

Bolay, P., Rozbeh, R., Muro-Pastor, MI, Timm, S., Hagemann, M., Florencio, FJ, Forchhammer, K. 和 Klahn, S. (2021)。新型 PII 相互作用蛋白 PirA 控制进入蓝细菌鸟氨酸-氨循环的通量。mBio 12(2) ：e00229-21。
Forchhammer, K. 和 Selim, KA (2020)。蓝藻中的碳/氮稳态控制。FEMS 微生物修订版44(1)：33-53。
福泰生物。(2005-2006)。八位字节系统用户指南。
福泰生物。(2019)。Ni-NTA 生物传感器动力学分析。
Orthwein, T., Scholl, J., Spät, P., Lucius, S., Koch, M., Macek, B., Hagemann, M.和Forchhammer, K. (2021) 。新型 P II相互作用物 PirC 将磷酸甘油酸变位酶鉴定为蓝藻中碳储存代谢的关键控制点。Proc Natl Acad Sci USA 118(6): e2019988118。
颇尔 FortéBio有限责任公司。(2011) 。 Octet ®系统数据分析用户指南。7.1 版。
Santos, ARS, Gerhardt, ECM, Parize, E., Pedrosa, FO, Steffens, MBR, Chubatsu, LS, Souza, EM, Passaglia, LMP, Sant'Anna, FH, de Souza, GA, Huergo, LF and Forchhammer, K. (2020)。细菌中的NAD +生物合成通过 PII 信号受全球碳/氮水平控制。J Biol Chem 295(18): 6165-6176。
Scholl, J.、Dengler, L.、Bader, L. 和 Forchhammer, K.（2020 年）。来自蓝藻集胞藻属的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。PCC 6803 受 PII 信号的全局代谢控制。Mol Microbiol 114(2): 292-307。
Selim, KA、Ermilova, E. 和 Forchhammer, K.（2020 年）。从蓝藻到古生菌：植物界 PII 信号的新进化见解。新植醇227(3): 722-731。
Shah, NB 和 Duncan, TM (2014)。用于测量蛋白质-蛋白质相互作用和变构配体效应动力学的生物层干涉仪。J Vis Exp (84)：e51383。
Shan, J.、Wan, Y.、Luo, C.、Ye, G.、Geng, Q.、Auerbach, A. 和 Li, F. (2020)。SARS-CoV-2的细胞进入机制。Proc Natl Acad Sci USA 117(21): 11727-11734。

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