材料和试剂

1. 1.5 ml E ppendorf 管（Starlab，目录号：S1615-5550）
2.塑料移液器吸头（最好过滤）（Starlab，目录号s ：S1122-1830 [1,000 μl] ；S1120-8810 [200 μl] ；S1123-1810 [20 μl] ；S1121-3810 [10 μl] ；S1121-3810 [10 μl] )
3.真空过滤器单元，孔径0.2μm （Thermo，目录号：568-0020）
4. 6 孔板（Costar，目录号：3516，或等效物）
5. 3 ml 塑料巴斯德移液器（Starlab，目录号：E1414-0311，或等效物）
6.组织处理/包埋盒（Simport，目录号：M490-4）（图 1，左）
7.不锈钢或塑料组织处理胶囊（图 1，右）
注意：图 1 中描绘的胶囊是作者使用的胶囊，但现已停产。因此，此处提出了替代选项：Simport，目录号：M470；或 Fisher，目录号：15-182-219；或等价物。

图 1.组织处理盒和胶囊

8.用于组织石蜡包埋的金属模具（Leica，目录号：3803081E）
9.用于工作表面消毒的RNaseZap ®湿巾（Invitrogen/Ambion，目录号：AM9788）
10. Superfrost ® Plus 载玻片（ThermoFisher Scientific，目录号：J1800AMNZ）
11.人类胚胎肾组织由 MRC 和 Wellcome Trust Human Developmental Biology Resource ( http://www.hdbr.org/ ) 提供
12. hPSC 衍生的肾脏类器官可以根据已发表的协议进行生产（Takasato等人，2015 年；Bantounas等人，2018 年和 2021 年）。在我们的研究中（Bantounas et al. , 2021 ），我们分化了MAN13人胚胎干细胞（hESC）系（Ye et al. , 2017 ），但原则上可以使用任何hESC或诱导多能干细胞（iPSC ）系。
13.用于包埋组织的石蜡，熔点61 °C （Pfm Medical，目录号：9000）
14.无核酸酶水（未经DEPC处理）（ThermoFisher Scientific，目录号：AM9930）
15.磷酸盐缓冲盐水（PBS），不含Ca 2+和Mg 2+ （Sigma，目录号：D8537-500 ml）
16. 5'-地高辛标记的 miRCURY ® LNA ® miRNA 检测探针（1 nmol）（见注 1 ）（QIAGEN，目录号：339111；见下文了解单个探针代码）。在这个例子中，我们使用了探针定位：
miR-199a-3p （QIAGEN，目录号：YD00615410）
miR-214-3p （QIAGEN，目录号：YD00611471）
乱序探针（阴性对照；QIAGEN，目录号：YD00699004）
U6 snRNA（阳性/优化对照；QIAGEN，目录号：YD00699002）
17. miRCURY ® LNA ®的miRNA ISH缓冲器组（FFPE）（QIAGEN，目录号：339450），其中包括：
2 × 无甲酰胺 miRNA ISH 缓冲液
蛋白酶K溶液
18. UltraPure TM 20 × SSC 缓冲液（Invitrogen，目录号：15557-044）
19. Tween-20（Sigma，目录号：P1379-250ML）
20.绵羊抗DIG-AP（碱性磷酸酶连接）抗体（Roche/Sigma-Aldrich，目录号：11093274910）
21.羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：S3772-10ML）
22.牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A1470-100G）
23.硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-吲哚基-磷酸（NBT/BCIP）即用型片剂（Roche，目录号：1 1 697 471 001）
24.左旋咪唑（Fluka，目录号：31742），用水稀释制成 100 mM 储备溶液
25.核固红溶液（默克，目录号：N3020）
26.工业甲基化酒精（IMS）（各种供应商）
27.二甲苯（各种供应商）
28. 100% 乙醇（各种供应商）
29. KCl （各种供应商）
30. KP Marker Plus（Histolab，目录号：98307-R）或类似的疏水标记笔（各种供应商）
31. 4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液（见配方）
32. 1 M Tris 缓冲液（见配方）
33. 0.5 M EDTA 溶液（见配方）
34. 5 M NaCl 溶液（见配方）
35. 1 ×蛋白酶 K 缓冲液（见配方）
36. SSC 缓冲液稀释（见配方）
37. PBS-T 0.1%（见食谱）
38.阻塞解决方案（见食谱）
39.抗体稀释缓冲液（见配方）
40. KTBT 缓冲液（见食谱）

设备

组织处理器（徕卡，型号：ASP300S ；或同等产品）
加热石蜡包埋站（Leica HistoCore Arcadia H 或同等产品）
冷板（Leica、HistoCore Arcadia C 或同等产品）
切片机（徕卡，型号：RM225 ；或同等产品）
杂交炉或其它可变温度培养箱（例如。，的Hybaid，南部双14或等同物）
显微镜载玻片架（Simport，目录号：M905-12DGY）
用于将载玻片架浸入溶剂/缓冲液中的罐子（Simport，目录号：M900-12G）
加热块（最高 90 °C ）（Eppendorf ThermoMixer F1.5 或同等产品）
微量离心机（Labnet、Prism 或同等产品）
Gilson ®或等效移液器（各种供应商）
用于在杂交和染色过程中固定载玻片的染色托盘（见图 2 ）。
注意：图 2 中描绘的托盘是作者使用的托盘，但现已停产。此处提出了替代方案：Fis her，目录号：22-045-035 。
水浴（Grant SUB6，目录号：P266 ；或等效物）
高压釜（各种供应商）
可选的成像：3D-Histech Panoramic-250 显微镜载玻片扫描仪，带有 40 × /0.95 Plan Apochromat 物镜（蔡司）

软件

可选：CaseViewer（3DHISTECH Ltd.；www.3dhitech.com），在使用 3D-Histech 幻灯片扫描仪扫描后捕获图像（参见设备中的第 14 点）
斐济/ImageJ ( http://imagej.net/Fiji/Downloads ) （用于捕获后的图像处理）

程序

组织固定
本节中描述的程序用于制备类器官组织，是对 Lopes等人中描述的程序的改编。（2019 年）。
如果从已经包埋在石蜡中的样品开始：直接跳到 B 部分，步骤 10。
以下程序假设在 6 孔板的 transwell 插入物中培养类器官（Bantounas等人，2018 年）。如果使用不同大小井和/或插入时，变化成比例地卷在小号TEPS甲1-甲7。
准备“洗涤”和“固定”6 孔板，允许每个 transwell 插入一个孔有机体：
洗板：在每个孔中加入 1.2 ml PBS 。
固定板：在每个孔中加入 1.2 ml 4% PFA 。
将 transwell 插入物从培养板转移到上面准备好的洗涤板。
小心地将 1 ml PBS 添加到每个 transwell 中并轻轻旋转板以洗涤有机体。
使用 Gilson 或 3 ml Pasteur 移液器，从 transwell 内取出 PBS。
从“洗”传送转孔的“固定”板（即。，在PFA已在每个孔中的顶部）。
将 1 ml 4% PFA 添加到每个 transwell 中，确保类器官被完全覆盖。
注意：如有必要，您可以添加更多 PFA以完全覆盖有机体。
在室温下孵育 20 分钟。
从转孔移除PFA并将它们转移到一个新的洗涤板，制备成在小号TEP甲1a中，以上。
通过重复用PBS洗两次类器官小号TEPS甲2-甲4如上述。
使用 3 ml 塑料巴斯德移液管，在 transwell 中取出一些最后一次洗涤的 PBS 并将其排出到每个类器官上，力道刚好足以将其移开（但注意不要用力过猛，否则会破裂）类器官）。
使用相同的 3 ml Pasteur，将每个有机体转移到一个单独的新鲜 1.5 ml Eppendorf 管中，其中含有 400 μl PBS。固定的有机体可以在 PBS中 4 °C下储存长达一周，然后再嵌入。

在石蜡中嵌入固定组织并切片
组织嵌入和切片的视觉指南，也适用于本节中的类器官，可在以下地址找到：https : //www.youtube.com/watch?v=7- LIbAWPc-g （已访问） 2021 年）。
标注号塑料组织包埋盒（点8 ，在材料和- [R eagents ;图1，左）等于用铅笔或永久性标记笔样品之间进行区分类器官的数量。
放置一个组织处理胶囊（点9 ，在材料和- [R eagents ;图1，右）到每个塑料组织盒，都与关闭盖子。
使用塑料巴斯德吸管，小心地将一个类器官转移到胶囊底座中。
更换组织处理胶囊上的盖子，然后更换组织盒上的盖子。
将卡带浸入 70% 乙醇中。
重复小号TEPS乙3-乙5为每个类器官。
将卡带转移到组织处理器（Leica ASP300S 或同等产品）并按照表 1 中列出的步骤运行程序。

表 1. 组织处理程序（R . T . ：室温）

第二天，将包埋盒从组织处理器中取出，使用加热石蜡包埋台将它们转移到石蜡中，如下所示：
打开塑料盒，然后是组织处理胶囊。
借助来自嵌入站的液体蜡，小心地将有机体推入金属模具中。
小心地将有机体放置在模具的中间。
允许在冷板上放置几秒钟（参见设备）。用液态蜡加满模具，将没有盖子的塑料盒放在模具顶部，让它在冷板上凝固约 2 小时。
重复小号TEPS乙8A- B8 d为每个类器官。
在切片和使用切片机之前，将块s 放入融化的冰/冰水的容器中至少 15 分钟，生成包含有机体的石蜡块的连续 5 μm 部分。
让组织切片在干净温暖的自来水表面上延伸（使任何折痕变直），然后将它们转移到标记的显微镜载玻片上。允许在温暖的盘子上晾干，并在一夜之间转移到 37 °C 的烤箱中进一步干燥。

组织切片的脱蜡
注意：本节中的所有步骤都应在化学罩中进行。
在开始该程序之前，准备一系列包含以下每个步骤中提到的溶剂溶液的 11 个罐子。
将载玻片放在载玻片架中，然后浸入一罐二甲苯中 5 分钟。
浸入第二个二甲苯罐中 5 分钟。
浸入第三个二甲苯罐中 5 分钟。
在装有 99.9% 乙醇的罐子中浸泡 10 次（每次2-3秒）。
在第二个装有99.9% 乙醇的罐子中浸泡 10 次（每次 2-3 秒）。
沉浸在3次99.9％的乙醇5分钟罐子。
在 96% 乙醇的罐子中浸泡 10 次（每次 2-3 秒）。
浸入第二罐 96% 乙醇中 5 分钟。
在装有 70% 乙醇的罐子中浸泡 10 次（每次2-3 秒）。
浸入第二罐 70% 乙醇中 5 分钟。
沉浸在一个PBS的5分钟罐子。

蛋白酶K处理
下面介绍的蛋白酶 K 浓度和处理时间针对 PFA 固定、石蜡包埋的人胚胎肾组织和肾类器官进行了优化。对于不同的固定方法和/或组织类型小号，这些参数需要被重新优化（见注2 ）。
每毫升蛋白酶 K 缓冲液（参见配方 5 ）加入 0.75 μl 蛋白酶 K 储备溶液以获得 1 ×蛋白酶 K 试剂。（Bantounas对于我们的固定/组织组合等。，2021），我们确定了最佳浓度为0.33 × ; 因此，用蛋白酶 K 缓冲液进一步稀释 1 ×蛋白酶试剂 1：3（见注 2 ）。为每个要染色的切片制作大约 300 μl 的最终试剂的足够工作溶液（尽管在有机体的情况下，更少可能就足够了）。
将载玻片放在平坦的表面上，将 300 μl（或足以覆盖切片）的蛋白酶 K 试剂直接涂在每个切片上。
将载玻片转移到预热的杂交炉中，并在 37 °C下孵育10 分钟（见注 2 ）。
将载玻片放在载玻片架上，浸入一罐 PBS 中洗涤两次。

探针杂交
下面给出的最终探针浓度和杂交温度特定于我们在 Bantounas等人中研究的 miRNA 。( 2021 )并作为示例给出。这些参数应该针对每个单独的 miRNA 单独优化（参见注释 3 ）。我们建议在感兴趣的 miRNA 旁边，使用阴性对照（乱序）探针，以及阳性（U6 snRNA）探针（另见表 2 ）。
用等体积的无 RNase 水稀释2 × Formamide-free miRNA ISH 缓冲液，以获得 1 × miRNA ISH 缓冲液。对于所有探针/部分的组合（见足够准备小号TEP ë 2）。
在无 RNase 的E ppendorf 管中，在 1 × miRNA ISH 缓冲液中适当稀释探针储备，以获得所需的工作/最终浓度 LNA ®探针混合物（参见注释 3 ）。表 2 显示了在 Bantounas等人中使用的在不同最终浓度下优化的探针示例。（2021 年）。最终体积应该足以为每个切片添加 50 μl （尽管您可以根据切片的大小放大或缩小）。

表 2.用于肾脏组织/类器官的 LNA ®探针的储备和最终浓度示例

将管子放在加热块中，在 90 °C 下加热4 分钟，使探针变性。然后，短暂离心以收集管底部的所有液体。
通过在底部放置湿纸巾并将幻灯片放在顶部来准备一个幻灯片固定染色托盘,如图 2A所示。
将 50 μl LNA ®探针混合物涂抹在每个切片上，并盖上染色托盘的盖子（图 2B ）。

图 2.在染色托盘上设置载玻片，下面有湿组织，以防止在杂交过程中应用的溶液蒸发

将滑动盒放入 55 °C的烤箱中（见注 3 ）1 小时。
从烤箱中取出载玻片盒，将载玻片放入载玻片架并浸入含有 5 × SSC 缓冲液的罐子中（配方 6 ）。
制备一系列的含有不同浓度的六缸的SSC缓冲液（见配方6 ），如下面详述在表3中，并且通过在它们中的每连续浸渍5分钟洗滑动。将罐子放在设置为杂交温度的水浴中，最后一个 (#6) 除外，它应该在室温下。

表3 。探针杂交后的严格洗涤

将载玻片转移到装有 PBS 的罐子中

结合探针的抗体检测和可视化
注意：在下面的封闭和免疫染色步骤中，不要让组织切片变干，因为这会导致非常高的背景信号，也有损害组织完整性的风险。
使用 KP 标记（参见材料），在每个部分周围应用疏水屏障
每切片加入 50 μl（或足以覆盖切片）封闭液（配方 8 ），并在室温下孵育 15 分钟。
在封闭过程中，在抗体稀释缓冲液（配方 9 ）中以1:400（见注 4 ）稀释抗地高辛（抗 DIG-AP）抗体，每个切片允许 50 μl（或足以覆盖切片）。
通过倾斜载玻片去除封闭溶液，然后将抗体应用于切片，并在室温下与抗体一起孵育 1 小时。
将m放在载玻片架上，依次浸入三个装有新鲜 PBS-T 0.1%（配方 7 ）的罐子中，每次 3 分钟，将载玻片清洗 3 次。
要制备 AP 反应底物，请将n NBT-BCIP 片剂溶解在 10 ml 蒸馏水中。然后，添加 20 μl 左旋咪唑原液（参见配方）（每毫升 NBT-BCIP 溶液 2 μl）。
注意：底物溶液必须立即使用并避光。
每部分应用 50 μl（或足以覆盖该部分）底物，并在 30 °C烤箱中在黑暗中孵育 2 小时（见注 5 ）。
要停止反应，请将载玻片放在载玻片架中，然后浸入含有 KTBT 缓冲液（配方 10 ）的罐子中5 分钟。
重复上述洗涤第二次。
用蒸馏水清洗载玻片两次，每次 1 分钟。
应用 50 μl（或足以覆盖切片）核固红复染剂 1 分钟。
将载玻片放入载玻片架并放入盛有自来水的罐子中。在流动的自来水下冲洗 10 分钟。
可以使用明场显微镜检查和成像载玻片。miRNA 阳性细胞将被染成蓝色。或者，要详细捕获整个部分，请使用3D-Histech Panoramic-250 显微镜载玻片扫描仪。随后，可以使用CaseViewer 软件分析图像和捕获快照，并使用 ImageJ 进一步处理。代表性的结果可以在图 3 中看到。

图 3. 通过与地高辛标记的 LNA ®探针原位杂交检测人胎儿肾脏切片（妊娠第 12 周）中的 miRNA 。MiR-199a-3p存在于基质和未成熟肾小球中，而miR-214-3p存在于基质、未成熟肾小球和肾小管（g：肾小球；t：肾小管；str：基质）。比例尺为 50 μm。

笔记

QIAGEN推荐小号用于miRNA检测使用双标记的（5'和3' ）地高辛探针。然而，我们发现在我们的组织/miRNA 组合中，单标记 (5') 探针以较低的成本提供了良好的结果。可能对于其他组织/miRNA 组合，双标记探针确实是必要的（例如，对于较少丰度的miRNA）。
该协议假定组织切片的 PFA 固定和石蜡包埋。如果这些条件中的任何一个发生变化，蛋白酶 K 浓度和治疗持续时间可能需要重新优化，即使对于相同的组织类型也是如此。在这种情况下小号，导频实验必须使用阳性对照（U6）LNA进行®探针，改变蛋白酶K试剂的范围0.03之间×和2 ×并孵育10分钟。然后，使用给出最佳结果的浓度并进行第二次试点实验，在 5分钟到 30 分钟之间改变治疗持续时间。
最佳的 LNA ®探针浓度是 miRNA 特异性的，最佳杂交温度通常比其 T m （由制造商提供）低30 °C左右。可以对每个探针进行先导实验，在 5 nM 和 80 nM 之间改变浓度（尽管有时最佳浓度甚至可能低于此值；例如，我们研究中使用的miR-214-3p探针为 1 nM； Bantounas等人。，2021）。我们的协议中提到的55 °C通常是作为杂交温度的一个很好的起点，但可以在后续的试点实验中确定最佳值，并且通常落在 50 °C到 60 °C 的范围内。Ñ OTE：即，能够无阳性结果列于探针浓度优化步骤最初获得，在这种情况下，应该首先使用中档探针浓度（例如优化的温度，10-20纳米），随后你应该进一步细化浓度。
如果需要，可以使用 1:200-1:2 , 000范围内的稀释度来优化抗体稀释度。
如果 2小时的开发时间导致信号太强或太弱，您可以改变 AP 底物的孵育时间。对于某些组织/miRNA 组合，您可以在光学显微镜下观察颜色的变化，并相应地停止或延长孵育时间。

食谱

4% 多聚甲醛 (PFA) 溶液
向玻璃烧杯中加入 800 ml 1× PBS 并加热至 60°C，同时在加热的搅拌板上，在化学罩中搅拌。
然后加入 40 克粉煤灰。通过滴加 10 M NaOH 来提高 pH 值，直到 PFA 进入溶液（溶液变得清澈）。
让溶液冷却至室温并过滤（例如，使用真空过滤装置）。
用 1 × PBS将体积调节至 1,000 ml 。
再次检查 pH 值并用少量 1 M HCl 调节至 6.9。
在 -20°C 下以 10 ml 等分试样储存。解冻的等分试样可在 4°C 下储存长达 1 个月。
1 M Tris 缓冲液
在 800 毫升蒸馏水中，溶解 121.1 克 Tris 碱。
通过添加浓 (37% w/v) HCl (约 70 ml) 将 pH 值调节至 7.4。
在最终调整 pH 值之前确保溶液处于室温，然后在高压灭菌前将总体积调整为 1,000 毫升。在室温下无限期储存。
0.5 M EDTA 溶液
向 800 ml 蒸馏水中加入 186.1 g 二钠-EDTA∙2H 2 O。
在使用磁力搅拌器搅拌的同时，使用 NaOH 将 pH 值调整为 8。用水定容至 1,000 毫升。
高压灭菌并在室温下储存。如果 EDTA 从溶液中沉淀出来，则丢弃。
5 M 氯化钠溶液
将 292.2 g NaCl 溶解在 800 ml 蒸馏水中。
用水定容至 1,000 毫升。
高压灭菌并在室温下无限期储存。
1×蛋白酶K缓冲液
900毫升不含Rnase水，加入：
5毫升的1的1M Tris-HCL，pH为7.4
2 毫升 0.5 M EDTA
0.2 毫升 5 M 氯化钠
使体积达到 1,000 毫升，然后高压灭菌。在室温下无限期储存。
SSC 缓冲液稀释
5 × SSC：将 250 ml 20 × SSC添加到 750 ml 蒸馏水中
1 × SSC：将 50 ml 20 × SSC添加到 950 ml 蒸馏水中
0.2 × SSC：将 10 ml 20 × SSC添加到 990 ml 蒸馏水中
高压灭菌并在室温下无限期储存。
PBS-T 0.1%
向 1 L 1 × PBS 中加入 1 ml Tween-20。在室温下最多可存放 1 个月。
封闭溶液（p每次repare新鲜）
每 1 ml PBS-T 0.1%（参见上述配方 7 ），添加 20 μl 绵羊血清（2% v/v）和 10 mg BSA（1% w/v）。根据需要扩大规模。
抗体稀释缓冲液（p每次repare新鲜）
将等体积的 PBS-T 0.1%（参见上述配方 7 ）与 PBS混合，制备 PBS-T 0.05% 。
然后，每 1 ml 所得溶液加入 10 μl 羊血清（1% v/v）和 10 mg BSA（1% w/v）。
KTBT 缓冲器
900毫升不含Rnase水，加入：
7.9 克 Tris-HCl
8.7 克氯化钠
0.75 克氯化钾
用水和高压釜使体积达到 1,000 毫升。在室温下无限期储存。

致谢

该协议在原始研究论文（Bantounas等人，2021 年）中使用，其中探针结合和可视化部分是对 QIAGEN 的 miRCURY ® LNA ® miRNA 检测中推荐的协议的改编和一些修改探针手册（2017 年 10 月版）。以下机构资助了原始研究：英国研究与创新/医学研究委员会 (MRC) 英国再生医学平台中心 Grant MR/K026739/1；英国肾脏研究 John Feehally-Stoneygate 项目和创新奖 JFS/RP/008/20160916；生命肾脏泵启动补助金；地平线 2020 Marie Skłodowska - Curie Actions 初始培训网络 RENALTRACT (642937) 赠款，EPSRC/MRC 博士培训中心赠款 EP/L014904/1。我们感谢 Adrian S. Woolf 提供了从MRC 和 Wellcome Trust 人类发育生物学资源获得的人类胚胎组织。我们也感谢曼彻斯特大学的生物成像中心实验室帮助我们捕捉到的图像˚F igure 3。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

在母亲同意和伦理批准 (REC 08/H0906/21+5) 后收集的人体组织由MRC 和 Wellcome Trust 人类发育生物学资源 ( http://www.hdbr.org/ ) 提供。

参考

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