材料和试剂

AnaeroJar TM 2.5 L 罐（Oxoid ® ，ThermoFisher Scientific，目录号：AG0025A）
AnaeroGen TM厌氧气体发生袋（Oxoid ® ，Thermo Fisher Scientific，目录号：AN0025A ）
刃天青厌氧指示剂条（Oxoid ® ，Thermo Fisher Scientific，目录号：BR0055B）
100毫米无菌皮氏d ishes（FISHERBRAND，赛默飞世尔科技，产品目录号FB0875712）
的Pyrex ® Erlenmyer烧瓶250毫升（康宁TM ，赛默飞世尔科技，产品目录号：CLS4980250）
50 ml锥形离心管（Corning TM Falcon，Thermo Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
0.45 µm注射器过滤器（JG Finneran，目录号：FEC0425PC）
30 ml 无菌注射器（BD Slip tip 无菌注射器；Thermo Fisher Scientific，目录号：BD 302833）
38.5 ml 超速离心管（薄壁超透明管；Beckman Coulter，目录号：344058）
5 ml 超速离心管（薄壁超透明管；Beckman Coulter，目录号：344057）
1 ml无针注射器（Henke Sass Wolf，目录号：4010.200V0）
1.5 ml 离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：P190411）
与 ZetaSizer Nanoseries 兼容的一次性细胞（Malvern Panalytical，目录号：DTS 1070）
乳酸菌种，即，
嗜酸乳杆菌(ATCC 53544)
干酪乳杆菌(ATCC 393)
罗伊氏乳杆菌(ATCC 23272)
植物乳杆菌(ATCC BAA-793)
de Man、Rogosa 和 Sharpe（MRS）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：69966-500G，根据制造商的说明准备）
Tween ® 80（Sigma Aldrich，目录号：P8074）
4-15％的Mini-PROTEAN ® TGX预制蛋白凝胶（Bio-Rad公司，目录号：4561085）
GelCode TM Blue Stain Reagent（Thermo Fisher Scientific，目录号：PI24590）
10 ×磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9625）
4 × Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad，目录号：1610747）
2-巯基乙醇（Bio-Rad，目录号：161-0710）
SDS-PAGE 运行缓冲液（Bio-Rad，目录号：161-0772）
Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23225）
1-丙醇（Sigma - Aldrich，目录号：402893）
碳酸氢铵（Sigma - Aldrich，目录号：A6141）
胰蛋白酶，测序级（Promega，Fisher Scientific，目录号：PRV5111）
甲酸（Sigma - Aldrich，目录号：27001）
乙腈（Sigma - Aldrich，目录号：34851）
OptiPrep 培养基（Progen Biotechnik GmbH，目录号：1114542）
SDS-PAGE电泳缓冲液（10 ×库存;在使用1 × ）（见ř ecipes）

设备

能够保持 37°C 的培养箱（例如：Fisherbrand , Isotemp Microbiological Incubator）
容量为 50 ml 锥形管的离心机（例如：Beckman Coulter 、Avanti JXN-30 使用 JA-14.50 转子）
超速离心机可容纳 38.5 ml 试管，129,000 × g （例如：Sorvall WX Ultra 90 离心机，使用 AH-629 转子）
NanoSight LM10（英国伍斯特郡 Malvern Panalytical）
ZetaSizer NanoSeries 配备 HeNe 激光源（λ = 633 nm）和雪崩光电二极管（Malvern Panalytical，Worcestershire，UK）
Mini-PROTEIN ® Tetra 垂直电泳池（Bio-Rad，目录号：1658004）
Speed-vac（例如：Thermo Fisher Scientific SC210A SpeedVac Concentrator，目录号：SC210A-230）
Barocycler (Pressure Biosciences Inc., HUB 440-SW16, Easton, MA, US)
Orbitrap LC-MS/MS 系统（例如：配备 Nanospray Flex 离子源的 Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos（Thermo Fisher Scientific，目录号：ES071）
自动进样器（例如：Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 快速分离孔板自动进样器（Thermo Fisher Scientific，目录号：5840.0010）
超高效液相色谱（UHPLC）系统（例如：Dionex Ultimate 3000 RSLCnano 系统，Thermo Fisher Scientific，目录号：ULTIM3000RSLCNANO）

软件

NTA 2.3 纳米粒子跟踪和分析软件（Malvern Panalytical，Worcestershire，UK）
用于分散技术软件（DTS，马尔文PANALYTICAL，伍斯特郡，英国）d ynamic升飞行小号cattering分析
Scaffold 版本 4.8.2（Proteome Science Inc., Portland, Oregon, US），用于质谱分析后的蛋白质鉴定
Mascot（2.6.1版，Matrix Science，London，UK），用于质谱后的蛋白质鉴定
X！Tandem（版本 1.7.18）用于质谱分析后的蛋白质鉴定
R ( https://cran.r-project.org/ ) 和相关的 R 包：Peptides、Limma 和 ggplot2。用于鉴定蛋白质的生化分析、统计分析以及生成火山图或其他数据可视化

程序

膜囊泡 (MV) 的分离
培养细菌菌株
将冷冻原液或刺瓶中的每个菌株单独划线到 MRS 琼脂平板上。对于厌氧生长，将板放入 AnaeroJar 罐中，并添加 AnaeroGen 厌氧气体生成袋和厌氧指示剂。在 37°C 下生长约 48 小时或直至可见单个菌落。
将单个细菌菌落接种到 3 ml MRS 肉汤中。在 37°C 下过夜生长，不要像上一步那样在 AnaeroJar 中摇晃。
在无菌的 250 毫升锥形瓶中，从原代培养物中加入 1 毫升到 50 毫升 MRS 肉汤中。像前面的步骤一样在一夜之间生长。
收集并过滤上清液
将过夜培养物转移到 50 ml 锥形离心管中，并以 5 , 000 × g离心30 分钟。
将上清液倒入新管中，以 5 , 000 × g 的速度再次离心30 分钟。
重复小号TEP A2 b一次或两次以上，直到没有细胞沉淀是在侧面或后离心管的底部是可见的。这些额外的离心步骤不是严格要求的，但可以更容易地在后续步骤中过滤上清液。
将上清液通过 0.45 µm过滤器。这可以使用 30 ml 注射器和注射器过滤器或使用带有适当过滤器的真空装置来完成，以获取更大体积的上清液。
超速离心分离 MV
将 36 ml 过滤后的上清液转移到超速离心管中并组装到转子中。
在 4°C 下以 126,000 × g超速离心1.5 小时。
倒出上清液（颗粒通常是不可见的）。
加入 1 ml 1 ×磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 并在 4°C 下孵育过夜以重悬沉淀。
注意：如果进行梯度超速离心，请在 150 μ PBS-OptiPrep混合物的升代替（见小号TEP甲下面4A）。
梯度ü MV的ltracentrifugation
在 150 µl PBS-OptiPrep 混合物（45% v/v）中重悬 MV 颗粒，并将悬浮液移至 5 ml 超速离心管的底部。
制作几个 0.8 ml 较低密度的 PBS-OptiPrep 溶液（例如，35%、30%、25%、20%、15% 和 10%），然后依次用密度降低的层覆盖含有 MV 的基层。添加时避免添加气泡或破坏之前的图层。
添加所有层后，让管子静置 1 小时。
使用 AH-650 转子在 Sorvall WX Ultra 90 离心机中以 236,000 × g超速离心梯度3 小时。
离心后，轻轻依次取出10 个等体积 (~500 μl) 级分并将其放入单独的管中。
使用下述方法评估不同密度分数的 MV 浓度、蛋白质组成和其他特征。

图 3.乳杆菌膜囊泡的纳米粒子追踪分析 (NTA) 。一个。从嗜酸乳杆菌MV的 NanoSight LM10 视频中获取的代表性帧。在NTA之前，从n MRS培养物纯化的MV在PBS中以1:1 , 000稀释。比例尺表示 2 µm。乙。NTA 结果的代表性 MV 大小分布，取自三个 60 年代视频的平均值。

MV Ç haracterization
纳米颗粒吨费尽一个nalysis （NTA），以确定颗粒尺寸分布和浓度
在 1 × PBS 中稀释 MV –进行多次连续稀释，例如 10 × 、100 ×和 1 、000 × 。当视野内有20-60个颗粒时，NTA软件检测颗粒效果最佳；因此，样品需要稀释，并且每个样本的最佳稀释度可能会发生变化，从一个隔离到另一个。
使用 1 ml 无针注射器，将稀释的样品加入 NanoSight 仪器室。留出时间让样品沉淀并调整显微镜焦距和相机设置，以优化 NTA 2.3 纳米颗粒跟踪和分析软件中相机视野中颗粒的清晰度。可以在室温下收集数据。
以每秒 30 帧的速度将数据捕获为 60 秒曝光的三次读数，并使用自动粒子检测和跟踪参数进行分析：检测阈值、像素模糊、最小轨道长度和最小预期粒子尺寸。从囊泡的NTA的代表性图像的嗜酸乳杆菌ATCC 53544在图3中示出作为NTA 2.3不自动比例尺信息添加到图像，它们可以是附加编由像素转换为微米通过除以像素乘以9.036 （使用30时× 目标）。
动态升飞行小号cattering（DLS）来测量MV尺寸分布
在 0.1 × PBS pH 7.4 中将MV 样品稀释 10 倍，然后添加到一次性 DLS 比色皿中。
使用配备 HeNe 激光源 (λ = 633 nm) 的 ZetaSizer NanoSeries 进行 DLS 分析，并使用色散技术软件进行分析。在 25 °C 下进行测量。对于每个样本，对自相关函数取 5 次运行的平均值，每次运行 10 秒，然后重复三到六次。
Zeta 电位测量以确定 MV 表面电荷
像 DLS 一样稀释 MV 样品并装入一次性比色皿中。
使用配备有 HeNe 激光源 (λ = 633 nm) 和色散技术软件的 ZetaSizer NanoSeries 测量 zeta 电位。在 25 °C 下对每个样品进行三次测量。
用于对 MV 中所含蛋白质进行定性分析的 SDS-PAGE
制备样品：根据 NTA 确定的 MV 浓度，在 1.5 ml 离心管中取等量的每个 MV 样品，体积≤15 μl。使用水或 1 × PBS 将样品体积调整至 15 μl 。（卷可以根据被调节的要使用的SDS-PAGE凝胶的孔容量）。
向每个样品中加入 5 μl（或所需体积以产生 1 ×终浓度）的 4 × Laemmli 上样缓冲液，然后通过煮沸 5 分钟、在冰上冷却 5 分钟并在 16,000 下离心 15 分钟使样品蛋白质变性× g在台式离心机中。
根据制造商的说明，使用4-15% Mini-PROTEAN ® TGX 预制蛋白质凝胶组装 Bio-Rad Mini-PROTEAN 垂直电泳槽。
将变性的 MV 样品（仅上清液）装入凝胶并在 200 V 下运行，直到染料前沿到达凝胶底部。
从外壳中取出凝胶并在水中短暂冲洗；然后，在 GelCode TM Blue Stain Reagent 中染色，然后用水脱色，以观察 MV 蛋白条带。Dean等人的图 3 。（2019 年）可以参考来自三个 LAB 物种的 MV 的 SDS-PAGE 凝胶的示例。
Shotgun 蛋白质组学分析以鉴定 MV 的蛋白质含量
样品制备
用 50 mM 碳酸氢铵 (ABC) 缓冲液中的 10 ml 10% 正丙醇重悬 MV 颗粒。
使用 Pierce BCA 蛋白质检测试剂盒标准化样品蛋白质浓度。
使用测序级改性胰蛋白酶以 1:50 (w/w) 酶: 底物比例在 barocycler 中消化溶液中的样品 (50 µg) 90 分钟（90 个循环：50 秒，45 kpsi，10 秒关闭）。
通过 speed-vac 蒸发消化的样品并储存在 -20 °C直到通过 LC-MS/MS 进行分析。
液相色谱-质谱/质谱
在 0.1% 甲酸水溶液（溶剂 A）中复溶干燥样品，并通过 Dionex Ultimate WPS-3000 自动进样器将 3 μg 消化的蛋白质加载到反相 C18 柱上，该自动进样器连接到配备 Nanospray Flex 离子源的n Orbitrap Fusion Lumos依赖数据的采集模式。
跨越2的90分钟梯度分离肽- 60％溶剂B（0.1％甲酸的乙腈溶液）在300标升/ min，使用的Dionex终极3000 RSLCnano系统的流率。
保存每个样本的原始、mgf 和 mzid 文件输出以供下游分析。
蛋白质鉴定
使用 Mascot 和 X 搜索质谱数据！串联使用适合生物体的基因组文件。使用 Scaffold 验证肽谱匹配。
将碎片离子质量容差设置为 ±0.60 Da，将母离子容差设置为 ±0.60 Da。将蛋白质识别阈值设置为≥2 个肽（蛋白质概率 80%，肽概率 95%）。将鉴定的蛋白质列表导出到 CSV。
使用 R 分析输出的 CSV 文件。

数据分析

蛋白质组学一nalysis：
使用 Mascot（Matrix Science，伦敦，英国）和 X! 分析所有 MS/MS 样品！串联（GPM，thegpm.org）。让 Mascot 设置搜索正确的数据库序列文件（由蛋白质 .fasta 输入生成）和相应的常见污染物文件。使用胰蛋白酶将假定的裂解设置为消化。
设置X！串联寻找正确的数据库序列文件的反向串联子集，其中只包含由吉祥物分析样品中鉴定的蛋白质。
使用支架（蛋白质组软件公司，波特兰，OR ，USA ），以验证MS / MS基于肽和蛋白质鉴定。将肽谱匹配设置设置为：碎片离子质量容差 = ± 0.60 Da，母离子容差 = ± 0.60 Da。将蛋白质识别阈值设置为≥2肽（蛋白质概率 80% ；肽概率 95%）。
使用 R 分析蛋白质组学数据输出到 CSV 文件
使用 Peptides R 软件包确定肽/蛋白质的理化特性。
使用经验贝叶斯方法执行双样本 t 检验，使用 Limma R 包调整每个蛋白质的方差估计，其输出是每个蛋白质的 log 2倍变化和缓和的 p 值对应于调节 t 统计量，如前所述（Dean等人，2020 年）。
使用 ggplot2 R 包创建火山图和数据的其他可视化（有关使用蛋白质组学数据的示例火山图，请参见图 4）。

图 4. 对乳酸杆菌膜囊泡进行蛋白质组学的火山图。相对于未处理的对照，在用诱导剂处理的嗜酸乳杆菌MV 中鉴定的蛋白质的 log 2倍变化的代表性火山图。通过基于 Limma R 包的经验贝叶斯方法将一式三份样品中鉴定的蛋白质数据放入并使用 ggplot2 绘制。有显着变化的蛋白质用蓝色表示。

食谱

SDS-PAGE 电泳缓冲液（10 ×库存；在 1 × 时使用）
25 mM Tris 碱
192 mM 甘氨酸
0.1% SDS
d我ssolve在水作为溶剂

致谢

该协议改编自以前的工作（Dean等人，2019 年和2020 年）。这项工作的资金是通过海军研究实验室 (SND, SAW) 的核心基金提供的。额外的财政支持是通过美国工程教育协会（ASEE）博士后奖学金计划（JCC）提供。图形摘要中显示的 AFM 图像由赖特帕特森空军基地空军研究实验室的 Claretta Sullivan 拍摄。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

此处描述的协议均不包括对动物或人类受试者的研究。

参考

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