材料和试剂

Eppendorf安全锁管，1.5毫升（Thermo Fisher Scientific ，Eppendorf，目录号：022363212）
PCR管（任何种类）
移液器吸头10μl，200μl，1,000μl （Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：2140-05、2160P，2079）
组织培养瓶T-75过滤瓶（Corning，隼® ，目录号：353824）
50mL锥形管中（Corning，隼® ，目录号：352098）
0.45 µm针头过滤器（全部，目录号：4508）
6孔板（Corning，目录号：CLS3516）
AmpliTaq Gold TM 360 预混液（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems，4398901）
向导® SV凝胶和PCR净化系统（Promega公司，目录号：A9281）
Platinum TM II Taq热启动DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：14966001）
MAXIscript TM T7转录试剂盒（赛默飞世尔科技，Invitrogen，目录号：AM1314）
PHUSION ® 高保真DNA聚合酶（赛默飞世尔科技，新英格兰生物实验室，目录号：M0530S）
具有SaCas9缓冲液的Gene Snipper TM SaCas9蛋白（来自金黄色葡萄球菌的CRISPR关联的核酸内切酶Cas9 ）：200 mM HEPES，50 mM MgCl 2，1 M NaCl，1 mM EDTA，pH 6.5 （Biovision，目录号：M1280 ）或SpCas9蛋白（CRISPR相关核酸内切酶从Cas9 S.pyogenes ）与1 X NE缓冲液3.1：100mM NaCl的，的50mM的Tris-HCl ，10毫摩尔MgCl 2 ，100微克/毫升BSA ，pH值7.9 （New England Biolabs公司，目录号M0386）
EZNA ® 微RNA试剂盒（欧米茄生物牛逼EK ，目录号：R7034-01 ）
QIAfilter质粒Midi试剂盒（Qiagen ，目录号：12245 ）
Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒（宝，目录号：631235）
BsmBI限制酶（Thermo Fisher Scientific ，New England Biolabs，目录号：R0580）
DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，目录号：69504 ）
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539 ）
P olyethyleneimine亚胺（Polysciences，目录号：23966，平均Mw约25000 ）
的Effectene（QIAGEN，目录号：301425）
NuPAGE TM LDS样品缓冲液（4 x ）（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，目录号：NP0008 ）
NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，目录号：NP0321PK2 ）
NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：NP0001）
硝酸纤维素膜（Bio-Rad，目录号：1620112）
奥德赛阻塞缓冲区（TBS）（LI-COR，目录号：927-50000 ）
IRDye 800CW（P / N：926-32211）或IRDye 680RD（P / N：926-68070）二抗（LI-COR）
Giemsa染色剂（Sigma-Aldrich，目录号：G4507或GS500）
分析缓冲液（请参见配方）
氯化钾
氯化镁2
特里斯
甘油
EDTA
安全数据表
溴酚蓝
反应停止缓冲液（请参见配方）

媒体

DMEM （Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：11960051 ）
Opti-MEM TM I （Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：31985 062 ）
胎牛血清（赛默飞世尔科技，GIBCO，目录号：26140079 ）
牛小牛血清（Thermo Fisher Scientific ，目录号：16030074 ）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：25030164 ）
G418 Geneticin （Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：10131035）
盐酸嘌呤霉素（Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：A1113802或Santa Cruz，目录号：sc-134220 ）
聚凝胺感染试剂（Millipore公司Sigma公司，目录号：TR- 1003-G 或圣克鲁斯：SC-134220 ）
GAMMAGARD LIQUID 免疫球蛋白输注（武田，夏尔，目录号：LE1500190，NDC：0944 2700 02）

质粒

慢病毒-SaCas9-sgRNA-Puro
可通过将SaCas9及其反式激活sgRNA克隆到慢病毒CRISPRv2质粒（addgene ＃52961）中获得C a 。使用BsmBI（NEB）和BamHI（NEB）消化lentiCRISPRv2，并使用DNA纯化试剂盒（Zymo）纯化。DNA组件可使用NEBuilder进行® 高保真DNA大会（NEB）根据制造商的方案用三个DNA片段，线性lentiCRISPRv2纯化，将含有因组序列（IDT，5' CTTTATATATCTTGTGGAAAGGA CGAAACACCGGAGACGtGATATCaCGTCTCAGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTGAATTCGTAGACTCGAGGCGTTGACAT TG双链DNA gBlock（IDT） 3′）和含有SaCas9的PCR片段。

psPAX2（Addgene质粒＃12260）
pVSV-G（Addgene质粒＃8454）

细胞系和培养基

人包皮成纤维细胞（HFF，Hs27，ATCC，目录号：CRL-1634），U2OS（称为U-2 OS，ATCC ，目录号：HTB-96），293T（ATCC，目录号：CRL-3216 ）和Vero （ATCC，目录号：CCL-81）细胞可以从美国典型培养物保藏中心获得。

HFF和293T细胞：Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有10％（V / V）胎牛血清（FBS）
V27细胞：DMEM补充了5％（v / v）FBS，5％（v / v）牛犊血清（BCS），2 mM L-谷氨酰胺和500μg/ ml的5％CO 2中的G418 （Rice 等人，1989）
U2OS和Vero细胞：DMEM补充了5％（v / v）FBS，5％（v / v）牛犊血清（BCS）和2 mM L-谷氨酰胺的5％CO 2 溶液
FO6细胞：维持在DMEM中，其中补充了5％（v / v）FBS，5％（v / v）BCS和2 mM L-谷氨酰胺以及50 0μg/ ml的G418（Gibco）和300μg/ ml的DMEM 5％CO 2中的潮霉素B（Invitrogen）（Samaniego 等，1997）

病毒

KOS菌株是常用的野生型HSV-1菌株（Schaffer 等，1970）。HSV-1 d 109是KOS菌株衍生的突变体，在所有五个早期早期（IE）基因中均被删除，并且在人巨细胞病毒（HCMV）IE启动子的控制下，包含绿色荧光蛋白（GFP）基因。 1个UL54 基因座。d 109可以在U2OS ICP4 / 27和FO6细胞上生长并滴定（Samaniego 等，1998）。

MiSeq适配器引物（表1）

正向接头引物：5 ' -TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - CRISPR位点的正向引物-3 '

反向接头引物：5 ' -TGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT - CRISPR位点的反向引物3 '

HSV-1基因特异性引物

UL30-5_for：5 ' -CCCAAGGTGTACTGCGGG-3 '

UL30-5_rev：5 ' -CTCCACGTTCTCCAGGATGT-3 '

UL29-3_for：5 ' -ATAGACTCGAGGGCCAGGG-3 '

UL29-3_rev：5 ' -TGACGAAAACCACGAGGGC-3 '

表1. MiSeq条码引物

引物ID

条码顺序

引物序列

BARCODE_FOR

不适用

aatgatacggcgaccaccgagatctacctctttccctacacgggct

BARCODE_REV_1

ATCACGA

caagcagaagacggcatacgagatTCGTGATgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_2

GA

caagcagaagacggcatacgagatTACATCGgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_3

塔加卡

caagcagaagacggcatacgagatTGCCTAAgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_4

泰格卡

caagcagaagacggcatacgagatTTGGTCAgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_5

ACAGTGA

caagcagaagacggcatacgagatTCACTGTgtgactggagttcagacgtgtGCT

BARCODE_REV_6

卡卡塔

caagcagaagacggcatacgagatTATTGGCgtgactggagttcagacgtgtGCT

BARCODE_REV_7

卡加塔卡

caagcagaagacggcatacgagatTGATCTGgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_8

ACTTGAA

caagcagaagacggcatacgagatTTCAAGTgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_9

GATCAGA

caagcagaagacggcatacgagatTCTGATCgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_10

塔格塔

caagcagaagacggcatacgagatTAAGCTAgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_11

GGCTACA

caagcagaagacggcatacgagatTGTAGCCgtgactggagttcagacgtgtgct

表1. 续

BARCODE_REV_12

CTTGTAA

caagcagaagacggcatacgagatTTACAAGgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_13

农业技术咨询委员会

caagcagaagacggcatacgagatGTTGACTgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_14

阿格

caagcagaagacggcatacgagatCGGAACTgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_15

ATGTCAG

caagcagaagacggcatacgagatCTGACATgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_16

CCGTCCC

caagcagaagacggcatacgagatGGGACGGgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_17

大赛

caagcagaagacggcatacgagatTGCGGACgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_18

GTGAAAC

caagcagaagacggcatacgagatGTTTCACgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_19

GTGGCCT

caagcagaagacggcatacgagatAGGCCACgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_20

TT

caagcagaagacggcatacgagatCCGAAACgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_21

总工会

caagcagaagacggcatacgagatACGTACGgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_22

嘎嘎嘎嘎

caagcagaagacggcatacgagatTCCACTCgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_23

阿塔加

caagcagaagacggcatacgagatTATCAGTgtgactggagttcagacgtgtgct

BARCODE_REV_24

ATTCCTT

caagcagaagacggcatacgagatAAGGAATgtgactggagttcagacgtgtgct

设备

移液器（能够从1μl-10ml精确移液）（任何来源）
热循环仪（Bio-Rad，型号：C1000）
涡流（任何来源）
微型离心机，容量达14 kG（Eppendorf）
培养箱（37°C）
DNA凝胶电泳仪
奥德赛CLx成像系统（LI-COR）
紫外线透照器（或手持式紫外线灯）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop 2000）

软件

Outknocker （http://www.outknocker.org/）
Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）
Mutct2（https://gatk.broadinstitute.org/hc/zh-cn/articles/360037593851-Mutect2）
Prism 6（6.01版）软件

程序

无细胞CRISPR / Cas9切割测定
设计sgRNA
鉴定必需基因（例如。，UL29 ，UL30 ，UL54 ，一个用于HSV-1 4）的病毒基因组内或DNA的区域。
在起始密码子下游〜1kbp 内设计合适的sgRNA靶序列。SaCas9切割的要求是在〜21个碱基对靶标的下游立即存在一个PAM序列（5'-NNGRRT-3'）。为每个病毒基因靶标选择多个独立的CRISPR sgRNA，以进行效率测试。
评估sgRNA的脱靶活性：sgRNA序列对于病毒基因组应该是唯一的，以防止人类DNA的脱靶切割。有关sgRNA鉴定和脱靶活性排名的有用网站是http://chopchop.cbu.uib.no/ [ CHOP CH OPv2 （Labun et al。，2016））和crispr.mit.edu（Zhang lab，MIT））（许等人，2013年）] 。
体外sgRNA合成
生成sgRNA的T7 体外转录模板
设计和订购用于sgRNA合成的寡核苷酸：对于每个sgRNA，设计一个60 nt的正向寡核苷酸（目标特异性寡核苷酸），包含T7启动子（5'-TAATACGACTCACTATA），然后是21 nt的具有特定SaCas9 sgRNA DNA结合序列的前两个核苷酸由GG（GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN）取代，用于T7起始，而sgRNA支架序列的恒定23 nt尾部用于退火（GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAA-3' ）。这些正向寡核苷酸与恒定的82 nt反向寡核苷酸（5'- AAAAAATCTCGCCAACAAGTTGACGAGATAAAC ACGGCATTTTGCCTTGTTTTAGTAGTAGATTCTGTTTCCAGAGTACTAAAAC-3' ）结合使用，编码tracrRNA尾巴的反向互补序列，以添加sgRNA不变的3'端寡核苷酸（SaCas9）。
带有尾部引物的退火sgRNA引物：对于每种sgRNA，在PCR管中组装以下反应：
试剂[ μl ]

寡核苷酸1（可变sgRNA寡核苷酸），100 μ中号1

寡2（恒定尾低聚），100 μ 中号1

H 2 O 8

Ť otal 10

退火协议：

在95°C 保持5分钟。

在95°C-> 85°C下以2°C / s的速度上升

从85°C-> 25°C以0.1°C / s的速度上升

保持在4℃。

通过在PCR管中为每个sgRNA组装以下反应，填充单链DNA（ssDNA）突出端以生成用于T7转录的双链DNA（dsDNA）模板（图1）：
试剂[ μl ]

AmpliTaq Gold TM 360预混液10

Taq 聚合物（5 U）1

来自ii。9

Ť otal 20

孵育在72 ℃下总共1个0.5小时，并添加另外的1 微升45分钟后的Taq。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903056--1518 Werner Neuhausser 856307 \ Figs jpg \ Fig 1.jpg

图1. T7 我Ñ体外sgRNAs的转录。60nt靶特异性寡核苷酸包含T7启动子序列，其后是21nt的金黄色葡萄球菌Cas9sgRNA DNA结合序列，前2个核苷酸被GG取代，SaCas9支架的23个核苷酸重叠序列。重叠序列与（恒定）SaCas9支架寡核苷酸的前23 nt互补。将两个寡核苷酸退火，并且两个寡核苷酸都通过DNA聚合酶从其3 '末端延伸，从而产生用于T7转录的双链DNA模板。RNA聚合酶识别T7启动子的双链DNA，并在“ GG”处启动转录。产生的sgRNA包含靶标特异性CRISPR序列以及RNA支架。

使用Promega向导清理试剂盒纯化dsDNA，并用20μlH 2 O 洗脱。
（可选）在琼脂糖凝胶上运行dsDNA模板以检查大小。
因组我Ñ体外转录（IVT）：
对于每个sgRNA，使用MAXIscript TM T7转录试剂盒和约150 ng dsDNA模板组装以下反应，并在37 °C 下孵育过夜：

试剂[ μl ]

ATP溶液2

CTP解决方案2

GTP解决方案2

UTP解决方案2

10X反应缓冲液2

Ť emplate DNA（150 毫微克）〜4

T7酵素混合2

H 2 O 4

Ť otal 20

注意：在室温下组装转录反应（如果反应在冰上进行组装，则10 x 反应缓冲液中的亚精胺可以共沉淀模板DNA）。在管中已经有水和核糖核苷酸后，添加10 x 反应缓冲液

除去模板DNA：向每个IVT反应中加入56μlH 2 O和4μlDNAse turbo，并在37 °C 下孵育15分钟。
sgRNA纯化：使用Omega EZNA PF试剂盒纯化sgRNA，并使用NanoDrop 2000 测量纯化的sgRNA 的浓度。在H 2 O 或测定缓冲液中洗脱。纯化后，将sgRNA分别稀释至200 ng / µl，并于-80储存 ℃。
（可选）确认RNA凝胶上sgRNA的预期大小（〜97bp）。
生成dsDNA底物用于体外切割测定
对于每一个因组扩增500-2 ，000 周围因组序列碱基对片段的从HSV-1基因组DNA使用PCR测试。如果扩增困难，用于裂解测定的dsDNA也可以作为g-blocks（IDT）获得。
使用Promega向导清理工具纯化PCR产物。
使用CRISPR sgRNA和SaCas9蛋白进行体外切割测定
试剂设置：
将测定缓冲液中的Cas9蛋白稀释至500 nM。
将纯化的PCR产物在H 2 O中稀释至50-100 ng /μl 。
确认每个sgRNA的浓度为200 ng /μl或更高。
裂解分析的组装：每个指南需要PCR条的四个孔。裂解试验是在10μl反应体积中进行的，最终SaCas9的终浓度为300 nM，100 nM，33 nM和0 nM，400ng sgRNA，200 ng dsDNA底物在1 x SaCas9核酸酶反应缓冲液中。
添加6 μ 的测定缓冲液l至孔中PCR条带2-4和6微升为500nM SaCas9蛋白与井1。然后加入2μl500nM的SaCas9蛋白添加到井2，混合，转移2微升的这对井3，混合并取出并丢弃2μl这种混合物。由于反应的最终体积为10μl，因此Cas9的最终浓度为300 nM，100 nM，33 nM和0 nM。
向4个孔中的每孔中加入2μlsgRNA。
在37 °C下孵育10分钟，以形成SaCas9 - sgRNA复合物。
将2μl纯化的PCR产物添加到4个孔的每个孔中。
在37 °C下孵育30分钟。
向每个孔中加入4μl反应终止缓冲液，并在80 °C 下孵育10分钟。
在2％琼脂糖凝胶和图像上运行所有反应的所有10μl。
分析：由于该分析提供了过量的sgRNA，因此SaCas9蛋白是限制因素。切割效率受到所提供模板总量的限制，但总的来说，效果良好的sgRNA表现出强劲的切割效果（在无SaCas9对照的0-50％强度下，条带较大），并且在较低的SaCas9浓度下有分级活性的证据。图2显示了结果我Ñ体外裂解测定靶向至关重要HSV三个因组Ü 大号30 克烯（编码病毒聚合酶）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903056--1518 Werner Neuhausser 856307 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

图2. 基本HSV-1基因U L 30的体外切割测定（Oh 等，2019）。A. 示意图我Ñ体外裂解测定; B.显示了靶向U L 30的三种sgRNA的结果（UL30-3，-4和-5）。T7 我Ñ体外转录因组用SpCas9蛋白和含有该CRISPR序列的PCR模板组合，温育1个小时，在37 ℃下和在琼脂糖凝胶上运行。泳道（1）SpCas9 + sgRNA，泳道（2）仅Cas9，泳道（3）仅sgRNA，泳道（4）无Cas9 / sgRNA。对于UL30-4和-5可以看到有效的切割，但对于UL30-3却没有。

使用下一代测序（MiSeq）的基于细胞的CRISPR / SaCas9切割测定
sgRNA的克隆到SaCas9慢病毒表达载体中
如前所述（Sanjana 等，2014; Shalem 等，2014），使用寡核苷酸在Bsm BI消化后将sgRNA CRISPR序列克隆到lentiCRISPR CRISPR SaCas9中（Sanjana 等人，2014; Shalem 等人，2014），以生成表达SaCas9的慢病毒载体，从而使sgRNA以及选择标记puro得以表达。
根据制造商的规程，使用无内毒素的Midiprep试剂盒（Qiagen）纯化质粒DNA。
慢病毒制剂
板3 X 10 6 在100mm培养皿20-24小时的人293T细胞转染前。
根据制造商的规程，使用Effectene 或使用p- 乙烯亚胺（PEI），用lenti-SaCas9-sgRNA-Puro（5 µg），psPAX2（4 µg）和pVSV-G（1 µg）转染293T细胞。
对于PEI转染，将500 µl Opti-MEMI（Gibco）中的总共10 µg DNA和500 µl Opti-MEMI中的30 µg PEI 混合。
混合DNA和PEI（共1 ml）并在环境温度下孵育20分钟。
将混合物直接添加到含有新鲜5 ml DMEM（补充有10％（体积/体积）FBS和2 mM谷氨酰胺）的293T细胞中。
将细胞在37 °C下孵育8-12小时，然后用10 ml新鲜DMEM 补充培养基，其中添加了10-30％（vol / vol）FBS和2 mM谷氨酰胺，然后在37 °C下继续培养。
每隔12-24小时进行48-60小时，收获培养基并换上新鲜的DMEM （补充10-30％（体积/体积）FBS和2 mM谷氨酰胺）。
将收集的培养基合并在冰上，使用0.45 µm注射器过滤器（颇尔）过滤合并的培养基。
可选：要浓缩，请在4 °C 下以25,000 rpm（Beckman的SW28转子，〜120,000 xg ）将病毒离心1.5 h 。
慢病毒滴定：根据制造商的规程，使用Lenti-X qRT-PCR滴定试剂盒（Takarabio）或qPCR慢病毒完全滴定试剂盒（abm）。
将慢病毒保持在0-4 °C 直至转导靶细胞（一天之内），或在-80 °C 冷冻以长期保存。
对于静态HSV感染：
在HFF细胞中建立静止的HSV-1 感染：
在含有0.1％葡萄糖（wt / vol）和0.1％BCS（v / v）的PBS中，以MOI为10 感染具有HSV-1突变d 109（缺失所有5个立即早期基因）的HFF细胞，持续1 h，在37 °C下摇晃（Ferenczy and DeLuca，2011）。
替换病毒接种物用DMEM补充有10％（V / V）FBS，孵育在37 ℃下为7- 10 天内进行付运。
SaCas9 / sgRNA转导包含静态HSV-1病毒基因组的HFF
在6孔板或T150烧瓶中分别用2或10 ml含有3-4 µg / ml聚丙烯的慢病毒（或MOI为5）转导d 109个感染细胞（可选：第二天重复慢病毒转导）。
第二天，用新鲜培养基替换转导培养基，并将细胞在37°C下孵育2天，然后用嘌呤霉素（1 µg / ml）处理7-10天。
HSV基因组DNA的分离：根据制造商的规程，使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）收获细胞并分离基因组DNA 。
对于溶血性HSV感染：
用SaCas9 / sgRNA转导HFF：
要用慢病毒转导HFF细胞以进行溶菌感染测定，请在转导前一天在T25烧瓶中以2 x 10 5 /孔的密度接种HFF细胞。
用2-5 ml慢病毒（或MOI为5）进行转导，包含3-4 µg / ml的聚丙烯（可选：第二天重复慢病毒转导）。
第二天，用新鲜培养基替换转导培养基，并将细胞在37°C下孵育2天，然后用嘌呤霉素（1 µg / ml）处理7-10天。
野生型HSV-1的淋巴感染
在含有0.1％葡萄糖（wt / vol），0.1％BCS（v / v）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以0.1或5的MOI用野生型HSV-1感染转导的细胞1 h，并于37 ℃ 。
用含1％BCS的DMEM 代替病毒接种物，并在37 °C 下孵育。
在各个时间点收获细胞，以通过qPCR和滴定进行病毒复制。
基因组和病毒DNA的分离：根据制造商的规程，使用DNeasy血液和组织试剂盒分离基因组DNA 。
深度测序（MiSeq）：深度测序的过程涉及初始PCR，在目标区域周围产生〜200 bp的产物，然后进行第二次PCR，以将条形码添加到扩增子中。此后，将每种产物在琼脂糖凝胶上电泳以确定每种扩增子的相对量。根据凝胶上扩增子条带的亮度，合并特定基因座的PCR产物，以使每个扩增子在最终合并物中均等代表。然后将合并的产物在琼脂糖凝胶上电泳并进行凝胶纯化，然后再进行测序。使用一组24个独特的条形码引物对，可以与一个深度测序样品并行分析总共24个sgRNA。
一个。带有目标基因特异性引物的衔接子（第一轮）PCR

设计一个引物组，在CRISPR位点附近产生一个约200 bp的产物，并将衔接子序列添加到正向和反向引物上（见图3）。CRISPR位点应位于扩增子的中心1/3，以在目标位点上获得良好的测序。衔接子序列在第二轮（条形码）PCR中用于引物退火。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903056--1518 Werner Neuhausser 856307 \ Figs jpg \ Fig 3.jpg

图3. 深度测序（MiSeq）过程。两步PCR（适配器PCR，条形码PCR）的示意图。第一步（适配器PCR）将基因特异性引物（黑色）延伸（橙色）用于第二步（条形码PCR）。以下序列是应该被添加到基因特异性引物的适配器：对正向引物衔接头序列：5'-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT靶序列特异性的3' ，适配器序列的反向引物：5' - TGG AGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT- 靶特异性序列-3'。条形码PCR引物与衔接子序列退火，并包含条形码（蓝色）以及与流动池结合的P5 / P7序列。三个测序读段覆盖扩增子/靶标序列并读取条形码。

根据以下协议，执行Phusion着陆PCR，该反应可提高反应的特异性。使用NEB计算器确定退火温度（http://tmcalculator.neb.com/#!/）。
试剂[ μl ]

5 x GC缓冲液2

dNTPs（10 毫米）0.2

˚F orward引物（25 μ M）0.05

ř EVERSE引物（25 μ M）0.05

T 模板（来自B4b- iii的〜1-10 ng gDNA ）1

Phusion聚合酶0.1

DMSO 0.3

水2 O 6.3

Ť otal 10

循环协议：

我nitial变性98℃30秒

15倍

d enaturation 98℃10秒

甲nnealing 72℃（-0.5℃/循环）30秒

È longation 72℃2分钟

15倍

d enaturation 98℃10秒

甲nnealing的Tm 30秒

È longation 72℃2分钟

˚F 伊纳勒伸长72℃5分钟

高温于4°C

在1.5％琼脂糖凝胶上运行少量（2μl）以确保PCR有效。如果是这样，请继续进行第二轮（条形码）PCR。
b。带有条形码引物的条形码（第二轮）PCR：此PCR使用通用引物（非基因特异性，请参见表1）将测序适配器和条形码连接到扩增子上。正向引物是相同的，但是有24条反向引物包含不同的条形码（用于并行测试多达24种不同的sgRNA）。

使用1μl第一轮PCR产物作为模板，设置标准的10μlPCR混合物，如下所示：
PCR Rx [ μl ]

5 x GC缓冲液2

dNTPs（10毫米）0.2

F 或病房引物（10μM）0.5

ř EV ERSE 引物（5μM）1

甲dapter PCR（模板）1.0

Phusion 0.1

DMSO 0.3

高2 O 4.9

Ť otal 10

循环协议：

我nitial变性98℃30秒

20倍

d enaturation 98℃ 10秒

甲nnealing 66℃ 20秒

È longation 72℃ 20秒

˚F 伊纳勒伸长72℃ 3分钟

高温于4°C

在1.5％琼脂糖凝胶上运行少量（2μl）。这样可以确保PCR正常工作，并在将PCR产物汇集在一起用于MiSeq时标准化每个扩增子的数量。值得注意的是，在某些情况下，除了正确的条带外，可能还会看到一个大的引物二聚体扩增子，大约175 bp。
合并扩增子并进行凝胶提取：
1）汇集（最多24个）不同sgRNA的扩增子 –不要将来自不同目标病毒基因的扩增子集中在一起，因为这会使凝胶提取更加困难。从先前的凝胶中，估计合并时的摩尔浓度相等（即，通过向池中添加更多的肽来补偿外观较弱的扩增子）。在MiSeq期间，这将使不同扩增子的读取计数均匀。

2）在1.5％琼脂糖凝胶上运行合并的扩增子，并使用Promega Gel Extraction Kit凝胶提取DNA。

使用16S元基因组测序文库制备试剂盒（Illumina）提交用于IlluminaMiSeq的纯化/合并扩增子。使用Qubit荧光计2.0（美国Life Technologies）和Qubit dsDNA高特异性测定试剂盒测定DNA浓度。通过IlluminaMiSeq（150 bp配对末端[ Gagnon 等，2014 ] ）测序DNA文库。
插入缺失分析：通过使用（http://www.outknocker.org/）量化包含1bp或更大插入或缺失的比对读数来确定每个sgRNA的插入缺失频率。使用ICE分析工具箱（https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis）分析indel大小。图4显示了在静止感染期间针对靶向基本HSV-1 基因U L 29和U L 30的sgRNA的HSV-1基因组中插入缺失突变的分析。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903056--1518 Werner Neuhausser 856307 \ Figs jpg \ Fig 4.jpg

图4.静态感染期间HSV-1基因组中的Indel突变（Oh 等人，2019）。A.静态d 109基因组的Indel 突变频率显示在指示的sgRNA目标位点。B. 直方图表示在静止的d 109基因组中由Sa Cas9 / UL30-5 诱导的插入缺失长度的频率（计数）。（-）删除（+）插入。C.显示在静止的d 109病毒基因组中由Sa Cas9 / UL30-5 诱导的突变的序列的例子。

分析人类病毒基因组的脱靶效应
如上所述，用表达SaCas9 / sgRNA的慢病毒和不含sgRNA的SaCas 9 转导HFF 。
根据制造商的规程，使用DNeasy血液和组织试剂盒分离基因组DNA 。
执行30 X SaCas9的全基因组测序（WGS）/因组处理的样品和对照。
要检测人类基因组中的脱靶效应：将WGS图读入人类基因组（hg38），并使用Mutct2的肿瘤正常调用将CRISPRed样品视为“肿瘤”，以鉴定sgRNA处理的HFF中人类基因组中的可能变异体相对于控件。在离线模式下使用Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）查找每个sgRNA在hg38中具有6个或更少错配的所有预测性脱靶位点，并确定预测变体和脱靶网站。
要检测病毒（HSV）基因组中的脱靶效应，请执行以下操作：将未映射的读数与HSV-1 KOS基因组序列（GenBank：KT899744）进行比对，并使用Mutct2的肿瘤正常调用来调用变体。然后可以确定HSV-1 KOS内预测变体与脱靶位点之间的重叠。

CRISPR / SaCas9抗病毒活性的功能测试（见图5A）

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903056--1518 Werner Neuhausser 856307 \ Figs jpg \ Fig 5.jpg

图5.CRISPR-Cas9对HSV-1裂解感染的作用（Oh 等人，2019）。A. SaCas9 / sgRNA介导的HSV裂解感染抑制实验方案。用表达SaCas9和sgRNA的慢病毒转导的B.和C. HFFs用MOV分别为0.1（C）或5（D）的HSV-1感染，并分别在48 hpi或24 hpi 收获。病毒产量可通过噬斑测定法确定。直方图显示了MOI为0.1（N = 3）或MOI为5（N = 4）时生物重复的平均值和标准差。与+ Cas9 / -gRNA相比，所有添加sgRNA的条件均具有统计学意义（t 检验，* P < 0.05）。D.用表达SaCas9和sgRNA的慢病毒转导的HFF以MOI为5感染HSV-1，并在10hpi收获。使用针对指定蛋白质的特异性抗体的免疫印迹法检测蛋白质。装有相同量蛋白质的三种SDS-PAGE凝胶用于检测多种蛋白质。GAPDH的免疫印迹显示为单个免疫印迹的对照。

抑制病毒蛋白表达：SDS-PAGE和免疫印迹
用蛋白酶抑制剂（cOmplete蛋白酶抑制剂混合物，Millipore Sigma）在1x NuPAGE样品缓冲液（Life Technologies）中裂解HFF细胞。
在NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶（Life Technologies）中分离样品。
将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad）上。
在Odyss ey封闭缓冲液（LI-COR）中将膜封闭1小时。
用针对特定蛋白质的抗体孵育膜[ 抗ICP4（1：3,000），抗ICP8（1：5,000），抗ICP27（1：5,000），抗UL30（1：2,000），抗GAPDH （1：10,000）和抗HA（1：5,000）] 在室温下放置1小时，或在4 °C 下放置过夜。
用PBS-T（含0.1％Tween 20的PBS）清洗膜5 x 5 分钟。
将膜与二抗IRDye 680RD（1：15,000 ，LI-COR ）或IRDye 800CW（1：15,000，LI-COR）孵育45分钟。
用PBS-T（含0.1％T的PBS在20之间的PBS）洗涤膜5 x 5 分钟。
使用Odyssey（LI-COR）检测近红外荧光，并使用Image J或ImageStudio V4（LI-COR）定量蛋白质表达水平（见图5D）。
抑制裂解复制
用SaCas9 / sgRNA转导HFF：
转导前一天，在T25烧瓶中以2x10 5 /孔的密度制备HFF细胞
用2-5 ml慢病毒（或MOI为5）和3-4 µg / ml的聚丙烯进行转导。
第二天，用新鲜培养基替换转导培养基，并将细胞在37°C下再孵育2天，然后用嘌呤霉素（1 µg / ml）处理7-10天。
野生型HSV-1的淋巴感染
在含有0.1％葡萄糖（wt / vol），0.1％热灭活的BCS（v / v）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以0.1或5的MOI用野生型HSV-1感染转导的细胞1小时在37 °C下摇动。
用含1％BCS的DMEM 代替病毒接种物，并在37 °C 下孵育。
在各个时间点收获细胞，以通过qPCR和滴定度进行病毒复制。
为了确定病毒滴度，收获培养基和细胞并与相同体积的高压灭菌奶粉混合并在-80 °C 下冷冻（将灭菌奶添加到常规培养基中可以稳定HSV （Blaho 等，2005））。
要分离完整的DNA（细胞和病毒DNA），请按照制造商的规程使用DNeasy血液和组织试剂盒分离基因组DNA 。
滴定病毒产量：
解冻培养基/牛奶中收获的细胞，并重复两次冻融循环（共3个循环）。
在含有0.1％葡萄糖（wt / vol），0.1％BCS（v / v）的PBS中稀释融化的样品（连续10倍，直到6-8个对数），然后将连续稀释的病毒接种物与适当的细胞类型单层一起孵育，前一天将其制备，在37 °C下摇动1 h 。
用含有1％BCS和0.17％人IgG的DMEM代替病毒接种物，并在37°C下孵育2-3天，直到出现斑块。
去除培养基并用100％冷甲醇固定细胞10分钟。
带有GIEMSA染色的单层污渍并计数噬菌斑（见图5B和5C）
抑制静止病毒的再激活（见图6A）

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1903056--1518 Werner Neuhausser 856307 \ Figs jpg \ Fig 6 .jpg

图6.CRISPR / Cas9诱导的静态d 109基因组的诱变及其对再激活的影响（Oh 等人，2019）。A. SaCas9 / sgRNA介导的HFFs 静止d 109基因组再激活抑制实验方案。HFFS感染了HSV-1 d 109病毒建立静态感染了7- 10 d AYS 和慢病毒表达SaCas9和sgRNAs 7-10转天。B.和C. HFF被d 109 感染，建立静止感染7-10 天，并用表达SaCas9和sgRNA的慢病毒转导7-10 天。为了重新激活d 109的静态基因组，将HFF用WT HSV-1以MOI为5 进行超级感染，并在24 hpi收获。通过在FO6和V27细胞上的噬斑测定来确定GFP 阳性的病毒产量。直方图显示了生物学重复的平均值和标准差（B和C：分别为N = 5和N = 7）。与+ Cas 9 / -gRNA 相比，所有添加sgRNA的条件均具有统计学意义（比率t检验，* P < 0.05和** P <0.01）。

在HFF细胞中建立静止的HSV-1 感染（Ferenczy和DeLuca，2011年）：
在37 °C 摇动下，在含有0.1％葡萄糖（wt / vol）和0.1％BCS（v / v）的PBS中，将MOI为10 的HSV-1 d 109突变病毒感染HFF细胞1小时。
孵育在37 ℃下为7-10 d AYS 在DMEM补充有10％（V / V）FBS。
SaCas9 / sgRNA 转导包含静态HSV-1病毒基因组的HFF
在6孔板或T150烧瓶中，用2或10 ml慢病毒（或MOI为5）和3-4 µg / ml polypolyene 转导d 109病毒感染的细胞。
第二天，用新鲜培养基替换转导培养基，并将细胞在37°C下孵育2天，然后用嘌呤霉素（1 µg / ml）处理7-10天。
要重新激活静止的d 109病毒，请在含有0.1％葡萄糖（wt / vol）和0.1％BCS（v / v）的PBS中以MOI为5的MOI将野生型HSV-1复染HFF细胞1小时，并在37 °C下摇动ç 。
将病毒接种物替换为含有1％BCS的DMEM，持续24 h。
于24 hpi收获细胞，并遵循上述步骤C2c中使用FO6和V27细胞滴定病毒产量的规程。
要计算绿色斑块的数量，请用1％甲醛的PBS溶液固定细胞10分钟。
要计算重新激活的d 109，计数绿色噬菌斑，并从FO6细胞上的GFP阳性菌斑数量中减去V27细胞上的GFP阳性菌斑数量。
重新激活分析：对于重新激活分析，重要的是包括一个用于WT HSV-1和d 109 之间重组的对照，该控件可能会将GFP序列转移至WT HSV-1并导致产生假GFP阳性噬菌斑。我们通过对互补FO6细胞上的GFP阳性噬斑进行计数，通过噬斑测定来量化d 109病毒的再激活。FO6是Vero衍生的细胞系，在HSV-1感染后表达ICP4，ICP27和ICP0，从而补充d 109病毒的复制（Samaniego 等，1998）。为了测量这些重组病毒，我们对在V27细胞上形成的GFP阳性噬菌斑进行计数，这些病毒在被HSV感染后会表达ICP27（而不是ICP4和ICP0）。因为ICP27 在HSV-1 d 109中被GFP 取代，所以出现的任何重组GFP阳性但ICP27阴性的HSV突变体（但不是HSV-1 d 109）都可以在V27细胞中复制。为了计算源自重新激活的d 109基因组的噬菌斑数量，我们从FO6细胞上的GFP阳性噬菌体数量中减去V27细胞上的GFP阳性噬菌体数量（请参见图6B和6C）。

数据分析

对照：我们为所有实验都提供了不含sgRNA的对照（仅限SaCas9）。

统计分析：我们至少使用三个生物学重复样本（在同一时间使用相同测试进行的独立实验）来确定统计学意义。我们使用Prism 6（6.01版）软件（GraphPad软件）进行统计分析。为了确定统计显着性，我们用学生的牛逼-测试，比配对牛逼- 检验或单向ANOVA，利用杜纳与多重比较检验双面（置信水平95％），（呵呵等，2019）。

菜谱

分析缓冲液（给出的浓度为最终浓度）
200毫米氯化钾

10毫米MgCl 2

20 mM Tris pH 8

存放在RT

反应终止缓冲液（酶测定）
30％的甘油重量为15克

0.5 M EDTA（6毫升）

重量t 1 g的2％SDS

少量溴酚蓝

用水将体积调至50 ml，并充分涡旋混合

存放在RT

致谢

NIH 的AI135423（KE和DMK）和AI106934 （DK）以及哈佛大学（DMK）的Q-FASTR奖为这项研究提供了支持。该方案和结果源自以下原始研究论文（Oh 等，2019）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

Bhaya，D.，Davison，M.和Barrangou，R.（2011年）。细菌和古细菌中的CRISPR-Cas系统：用于适应性防御和调控的多功能小RNA。Annu Rev Genet 45：273-297 。
Blaho，JA，Morton，ER和Yedowitz，JC（2005年）。单纯疱疹病毒：繁殖，定量和储存。Curr Protoc Microbiol 第14章：14E单元11。
钱伯斯（Chambers，SM，Qi，Y.），云母（Mica），李（Lee G.），张XJ（JX），牛（N.L.），比尔兹兰（Bilsland），J。，曹（L. SH和Studer，L.（2012年）。组合的小分子抑制作用加快了发育时间，并将人类多能干细胞转化为伤害感受器。Nat Biotechnol 30（7）：715-720。
Cong，L.，Ran，FA，Cox，D.，Lin，S.，Barretto，R.，Habib，N.，Hsu，PD，Wu，X.，Jiang，W.，Marraffini，LA和Zhang，F （2013）。使用CRISPR / Cas系统进行多重基因组工程。科学339（6121）：819-823。
JA的Doudna和E.的Charpentier（2014）。基因组编辑。CRISPR-Cas9基因组工程的新领域。科学346（6213）：1258096。
MW的Ferenczy和NA的DeLuca（2011）。ICP0逆转1型静态单纯疱疹病毒的异色沉默。病毒学杂志85（7）：3424-3435。
Gagnon，J.A.，Valen，E.，Thyme，S.B. ，Huang，P.，Akhmetova，L.，Pauli，A.，Montague，T.G.，Zimmerman，S.，Richter，C. Schier，A. F.（2014）。通过Cas9蛋白介导的寡核苷酸插入和单向导RNA的大规模评估进行有效诱变。PLoS One 9 ，e98186。
Gaj，T.，加州Gersbach和CF的Barbas，第三版（2013）。基于ZFN，TALEN和CRISPR / Cas的基因组工程方法。趋势生物技术31（7）：397-405。
Hsu，PD，Lander，ES和Zhang F.（2014）。用于基因组工程的CRISPR-Cas9的开发和应用。细胞157（6）：1262-1278。
Hsu，PD，Scott，DA，Weinstein，JA，Ran，FA，Konermann，S.，Agarwala，V.，Li，Y.，Fine，EJ，Wu，X.，Shalem，O.，Cradick，TJ，Marraffini ，洛杉矶，鲍国光和张飞（2013）。RNA引导的Cas9核酸酶的DNA靶向特异性。Nat Biotechnol 31（9）：827-832。
射频（RF）Itzhaki（2018）。证实1型单纯疱疹病毒在阿尔茨海默氏病中起主要作用。前沿衰老神经科学10：324。
金伯林（DW）（2004）。新生儿单纯疱疹感染。临床微生物学评论17（1）：1-13。
Kimberlin，DW，Lin，C.Y.，Jacobs，RF，Powell，DA，L，F.，Gruber，W.，Rathore，M.，Bradley，J.，Diaz，PS，Kumar，M.，Arvin，上午，古铁雷斯（Ktier），谢尔顿（M.），韦纳（Weiner），LB，斯利兹曼（Sleasman），西拉（de Sierra），TM ，宋杰（S.J.），莱克曼（Lakeman），FD，惠特利（Whitley），RJ和国家过敏与传染病研究所合作抗病毒药物研究组（2001年）。阿昔洛韦时代的新生儿单纯疱疹病毒感染的自然史。儿科108：223-229。
K.Labun，K.Montague，TG，Gagnon，JA，Thyme，SB和Valen，E.（2016）。CHOPCHOP v2：用于下一代CRISPR基因组工程的网络工具。核酸研究44（W1）：W272-276。
Liesegang，TJ，Melton，LJ，3rd，Daly，PJ和Ilstrup，DM（1989）。眼单纯疱疹的流行病学。1950年至1982年在明尼苏达州罗切斯特市的发生情况。眼科杂志107（8）：1155-1159。
Liu B.，Chen，S.，Rose，A.，Chen，D.，Cao，F.，Zwinderman，M.，Kiemel，D.，Aissi，M.，Dekker，FJ和Haisma，HJ（2020）。抑制组蛋白脱乙酰基酶1（HDAC1）和HDAC2可增强CRISPR / Cas9基因组编辑。核酸研究48（2）：517-532。
马里（Pali），杨（Lang），杨（L.L.），埃斯维特（Esvelt），KM，阿赫（Aach），杰尔（Guell），M。通过Cas9进行RNA引导的人类基因组工程。科学339（6121）：823-826。
哦，HS，Neuhausser，WM，Eggan，P.，Angelova，M.，Kirchner，R.，Eggan，KC和Knipe，DM（2019）。疱疹病毒的裂解基因功能使病毒基因组易于受到CRISPR / Cas9的新颖编辑。Elife 8：e 51662。
Rice，SA，Su，LS和Knipe，DM（1989）。单纯疱疹病毒α蛋白ICP27具有可分离的阳性和阴性调节活性。病毒学杂志63（8）：3399-3407。
Roizman，B.，Knipe，DM和Whitley，RJ（2013）。单纯疱疹病毒。领域病毒学。DM Knipe和PM Howley。费城，利平科特·威廉姆斯和威尔金斯：1823-1897年。
洛杉矶萨马涅哥（Samaniego），内德希泽（Lider），北卡罗来纳州DeLuca（1998）。在没有早期蛋白质的情况下单纯疱疹病毒基因组的持久性和表达。病毒学杂志72（4）：3307-3320。
Samaniego，LA，Wu，N.和DeLuca，NA（1997）。在没有ICP4和ICP27的情况下，单纯疱疹病毒即早蛋白ICP0影响病毒基因组的转录和感染细胞的存活。病毒学杂志71（6）：4614-4625。
东北部的Sanjana，O.Shalem和Zhang.F。（2014年）。改进的载体和全基因组文库，用于CRISPR筛选。Nat Methods 11（8）：783-784。
Schaffer，P.，Vonka，V.，Lewis，R.和Benyesh-Melnick，M.（1970）。单纯疱疹病毒的温度敏感突变体。病毒学42（4）：1144-1146。
O.Shalem，NE Sanjana，NE Hartenian，Shi，X.，Scott，DA，Mikkelson，T.，Heckl，D.，Ebert，BL，Root，DE，Doench，JG和Zhang，F。（ 2014）。人类细胞中基因组规模的CRISPR-Cas9基因敲除筛选。科学343（6166）：84-87。
汤普森角和惠特利角（2011）。新生儿单纯疱疹病毒感染：我们现在在哪里？生物医学进展697：221-230。
RM的Yarrington，S.的Verma，S.，Schwartz，S.，Trautman，JK和D.Carroll（2018）。核小体在体内抑制了CRISPR-Cas9 对靶标的切割。美国国家科学院院刊115（38）：9351-9358。
年轻，GT，居特里奇，A.，福克斯，HD，威布瑞，AL，曹，L.，乔，LT，棕色，AR，本恩，CL，Kammonen，LR，弗里德曼，JH，Bictash，M.，Whiting，P ，Bilsland，JG和Stevens，EB（2014）。在单细胞水平上表征人类干细胞来源的感觉神经元揭示了它们的离子通道表达及其在疼痛研究中的效用。分子理论22（8）：1530-1543。