材料和试剂

直径90毫米的无菌细胞培养皿（Iwaki，目录号：SH90-15）
22 mm x 40 mm微型盖玻片（Matusnami 玻璃，厚度为1，0.13-0.17mm ）
18 mm x 18 mm微型盖玻片（Matusnami 玻璃，厚度为1，0.13-0.17mm ）
20 ml注射器（Terumo，货号：SS-20ESZ）
无菌移液器吸头（Sorenson，1-200 µl刻度吸头，目录号：27730）
Kimwipes （Nihon Seishi ，货号：62011）
组织培养试验板，24 - 孔平板，无菌（TPP，目录号：92424）
使用前对牙签进行消毒（任何品牌）
表达两个高尔基标记的发芽酵母细胞和标记有不同荧光蛋白的分泌性货物。（有关详细信息，请参阅过程B ）
硅脂（道康宁东丽，目录号：HVG-50 TUBE）
伴刀豆球蛋白A（Sigma-Aldrich，目录号：C2010）
不含氨基酸的酵母氮碱基（Difco 实验室）
酪蛋白氨基酸（Difco 实验室）
葡萄糖（Nacalai Tesque ）
琼脂（和光）
MCD琼脂板（请参阅食谱）
MCD介质（请参阅食谱）

设备

微量移液器（Gilson，P ipetma n ，型号：P 200）
生物摇床（Taitec ，型号：M-BR-022UP）
SCLIM（图1）配备：
倒置荧光显微镜（奥林巴斯，型号：I X-73）
Objecti 已经透镜（奥林巴斯，UPlanSApo 100 X NA 1.4油物镜）
转盘共聚焦扫描仪（横河电机，CSU10定制型号）
CSU的其它类型的可以被使用（例如，CSU10，CSUX1，CSUW1）。共焦扫描仪配备了定制的分色镜，具有高光谱特性，可进行三色观察（Kurokawa 等，2013）。

激发激光器：固态3激光器，发射473 nm（Cobolt ，CW 473nm，DPSS，50 mW ），561 nm（Cobolt ，CW 561 nm，DPSS，50 mW ）和671 nm（CrystaL aser ，CW 671 nm），DPSS，100 毫瓦）
这三个激光器可以同时激发GFP，mRFP 或mCherry 和iRFP 。这3个激光器对样品的照射由3个独立的电磁百叶窗（Sigma Koki）控制。这些百叶窗是通过自定义的需求操作- 国产软件。可以使用可变ND滤镜调整3台激光器的照射功率。

分光镜单元：一种定制系统，该系统配备了定制的二向色镜，反射镜，带通滤光片和长通滤光片，可将3色荧光（绿色，红色和红外）图像分离到3个不同的通道（Kurokawa 等等，2013）
二向色镜和反射镜的角度可以从检眼镜的外部进行调整。

放大镜头（NIKON，VM 镜头C-4x [ 4x ] 或C-4x加C-2.5x [ 10 x]）
在共焦扫描仪和光谱仪单元之间的光路上放了一个放大透镜，以提高空间分辨率。

EM-CCD相机（滨松Pho 补品，C9100-13）
它们包含512 x 512帧传输CCD传感器。传感器的像素大小为16 x 16 µm。设置了3台EM-CCD摄像机以拍摄绿色，红色和红外荧光图像。

图像诠释器（滨松光电）
每个3个EMCCD相机都配备3个图像增强器。图像增强器使用定制的冷却系统进行冷却，以实现低信噪比放大。这三个图像放大器的放大增益是独立控制的。

压电执行器（横河电机，定制模型）
它安装在物镜的颈部，可在高频（最大30 Hz）下振荡透镜的Z轴位置。通常，我们以4-15 Hz的频率使用它。

温控台（Tokai Hit）
观察过程中样品的温度可以通过热控台控制。

图像采集系统
定制系统可控制在每个Z轴位置和每个时间点同时采集3台EM-CCD相机的图像（横河电机）。

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图1.设置三色SCLIM 。A. 倒置显微镜（a）与超快压电致动器（i ），定制的旋转盘共焦扫描仪（c），3个激发激光器（d），放大镜（f），定制光谱仪（包含二向色镜，折射镜以及带通滤光片和长通滤光片）（e），3个冷却的图像增强器（h）和3个EM-CCD照相机（g）。B.显示了定制光谱仪（e），3个冷却的图像增强器（h）和3个EM-CCD相机（g）的另一视图。

软件

Volocity 软件（Perkin Elmer）
MetaMorph 软件（分子设备）

程序

制备伴有Concanavalin A的玻璃盘，用于对活酵母细胞进行成像
伴刀豆球蛋白A用于将活酵母细胞固定在盖玻片表面上，以进行显微镜观察。

使SQUAR ê银行在18毫米×18毫米或与一个22毫米×40毫米玻璃盖（图2A）的硅润滑脂少1-2毫米的深度。硅脂通过带有切割端的吸液管头从注射器中挤出。

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图2.样品制备。A.一种方禁止ķ 在1-2毫米的深度为18毫米×18毫米或更小与上一个22毫米×40毫米玻璃盖硅脂制成。在方库内的盖玻片表面上涂有伴刀豆球蛋白AB。将酵母液体培养物的等分试样涂在经方刀豆素A涂层的22 mm x 40 mm盖玻片的方库中。C.将酵母液体培养物夹在伴有伴刀豆球蛋白A的海湾玻璃杯和18 x 18 mm盖玻片之间。然后对酵母细胞进行显微镜观察。

在方库内的盖玻片上涂抹约25 µl 0.2 mg / ml伴刀豆球蛋白A。
等待约2分钟，以用伴刀豆球蛋白A覆盖玻璃盖。
从玻璃表面上去除多余的伴刀豆球蛋白A溶液。
在室温下干燥伴刀豆球蛋白A约10分钟。需要新鲜制备伴有刀豆球蛋白A的玻璃皿，以很好地固定活酵母细胞。

酵母细胞的制备，用于货物运输的荧光显微镜脉冲追踪分析
酵母温度敏感突变体，例如一个小号sec31-1 和uso1-1 小号如何在ER到高尔基体运输的货物在限制温度的缺陷（37℃）。通过将热休克诱导型启动子的货物基因表达与酵母温度敏感性突变体的使用相结合，建立了荧光显微镜脉冲追逐分析法，以可视化从ER到高尔基体以及高尔基体内部的货物运输（黑川等人，2014年和2019年）。

拾取温度- SENSIT 香港专业教育学院突变酵母细胞中表达的货物和两个高尔基脑池标记物（例如，uso1-1 表达细胞热休克可诱导Axl2-GFP（跨膜货物）和组成型Mnn9-mCherry的（顺式-Golgi标记）和Sys1- 使用无菌牙签从冷冻原液中提取iRFP（反高尔基标记），并在MCD琼脂平板上用适当的氨基酸补充剂划线酵母细胞。
将酵母细胞在24°C的琼脂板上孵育2-3天。
接种的酵母细胞在1ml MC 与24适当氨基酸补充剂d介质- 孔板通过使用无菌牙签。
在500 rpm摇动下，于24°C将酵母细胞培养至对数的早期至中期。
在37°C下孵育酵母细胞15-30分钟，以诱导带有GFP标签的货物（Axl2-GFP）合成并抑制ER到高尔基货物的运输。
将约100 µl酵母液体培养物倒入方形的伴刀豆球蛋白A涂层的22 mm x 40 mm盖玻片中（图2B）。
等待2分钟，直到将酵母细胞固定在Concanavalin涂层盖玻片上。
用18 mm x 18 mm的盖玻片盖住方形堤（图2C）。
注意：酵母细胞可以生长良好，因为两个盖玻片之间用硅脂隔开。

用Kimwipes 从两个盖玻片的三明治夹层中清除溢出的酵母液体培养物。
将夹有酵母细胞的盖玻片放在显微镜载物台上，并用伴刀豆球蛋白涂层的大玻璃杯向下放置。显微镜载物台和物镜的温度可以通过自动温度控制系统设置为24°C。

使用SCLIM进行图像采集
观察前设置SCLIM
由于各种因素，例如整个显微镜和光谱系统中镜头的色差，可能会将来自同一位置（XYZ）的3个不同的荧光信号投影到3个相机的不同位置（XYZ ）。为了同时进行3色3D和4D观察，必须校正这些荧光信号的XYZ失准。SCLIM设计了一种方法，可以使用荧光珠校正3台摄像机中XYZ位置的不对准（请参阅过程F）。设置SCLIM需要一位熟悉SCLIM系统光学特性的专业操作员。

图像采集
荧光分子具有广泛的发射范围。因此，例如，当以非常高的水平表达GFP时，甚至可以通过具有更长波长的发射器的照相机来检测GFP的荧光信号。荧光信号的这种泄漏称为渗漏或串扰。尽可能避免此类泄漏信号至关重要。应独立控制3台激发激光器的功率和3台图像增强器的放大增益，以最大程度地减少渗漏。用户需要接受有关如何正确操作SCLIM的培训，以进行“图像获取”步骤。

通过SCLIM观察表达货物的酵母细胞（热休克诱导型Axl2-GFP）和高尔基氏脑部标记，顺式- 高尔基体标记（Mnn9-mCherry）和反式- 高尔基体标记（Sys1-iRFP）。在这些细胞中，我们可以观察到标记有Mnn9-mCherry的顺式-Golgi储水池成熟，而保留了Axl2-GFP的货物则变成了用Sys1-iRFP标记的反式-Golgi储水池。
2D共焦荧光数据在定制光谱仪中分离。GFP，mCherry 和iRFP 荧光图像最终穿过由2个带通滤光片（GFP; 490-545 nm和mCherry ; 580-660 nm）和1个长通滤光片（iRFP ; 680 nm-）定义的光谱窗口，并且同时由同步的3个EMCCD摄像机收集。
在观察时间内以适当的时间间隔（例如，在总共2-3分钟的观察过程中每约5秒）收集Z片三色图像。Z轴的适当范围（例如3μ米约酵母细胞体积的80％）盖由装有物镜压电致动器扫描到光学片相隔100纳米。
原始数据集（每个时间点的Z切片3色图像）曾经以TIFF格式存储在图像采集计算机的硬盘存储器中。

使用Volocity 软件从原始数据集中重建3D图像并制作反卷积3D图像
将原始数据集传输到装有Volocity 软件的计算机上。
使用Volocity 软件从原始数据集中重建3D图像。
从Volocity的“动作”菜单中选择“新建”，以制作图像序列。
将3个通道的原始数据集读出到图像序列中，以在每个时间点重建3D图像（图3A）。
从“工具”菜单中选择“消除噪声”，然后使用精细滤镜消除所有3D图像中的噪声。
从“工具”菜单中选择“更改颜色”，然后更改3个通道的颜色（例如，GFP为绿色，mCherry 为红色，iRFP 为蓝色）。
从“工具”菜单中选择“正确的光漂白”，然后校正3D图像的光漂白，以维持在观察时间内因光漂白而降低的强度。
从“编辑”菜单中选择“属性”，然后更改3D图像中XYZ像素大小的信息。像素（X）的和（Y）是0.06 μ m和的（Z）像素是0.1 μ 米，当我们使用100个物镜和4个放大透镜和扫描Z轴与光学片相隔100纳米。
从“工具”菜单中选择“快速恢复”，然后使用针对转盘共聚焦扫描仪优化的3种荧光蛋白的PSF（点扩展功能）参数制作反卷积3D图像。这些参数是通过“操作”菜单中“新建”中的“计算的PSF”来设置的。
原始3D图像和反卷积3D图像可以以不同的查看模式，XYZ模式（图3B），3D不透明度模式（图3C）等显示。

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图3. 原始和反卷积3D图像的重建。A. 显示了每个时间点在3个通道中的原始数据集的图像序列。B. 在某个时间点重建的原始和反卷积3D图像以XYZ模式显示。C.在3D不透明度模式下显示了在一个时间点重建的原始和反卷积3D图像。顺式- 高尔基体（Mnn9-mcherry，红色）和反式- 高尔基体（Sys1-iRFP，蓝色）存在于细胞质中。一些货物（Axl2-GFP，绿色）被运输到它们的最终目的地，质膜。在高尔基水箱内本地化的其他货物。图像中的虚线圆圈突出了酵母细胞的边缘。

3D和4D图像的呈现和分析
可以手动选择反卷积3D图像中的感兴趣区域。将图像显示为XYZ模式，并使用选择工具（图4A，左面板）勾勒出感兴趣的区域。从“操作”菜单中选择“裁剪为选定内容”以创建新的反卷积3D图像（图4A，右2个面板）。以3D不透明度模式显示的3D图像可以任何所需角度呈现（图4A，右2个面板）。
为了分析荧光信号强度随时间的变化，我们使用“电影”菜单（视频1）中的“制作电影”制作了解卷积3D图像的延时电影。在3个通道（绿色，红色，和红外线）3D图像的总荧光信号强度被收集以计算的相对荧光强度值例如，Axl2-GFP（货物，绿色），Mnn9-mCherry的（顺式-Golgi，红色），和使用Metamorph的Sys1-iRFP（反高尔基，蓝色）（图4B，视频1）。请注意，通过使用3D不透明度模式，我们可以制作各种角度的3D图像，这有助于避免收集到另一个高尔基水箱的错误荧光信号（图4B，箭头）。
为了分析货物和高尔基体蛋白的正确定位，可以将使用3D不透明度模式显示的3D图像以任意角度用于使用MetaMorph 进行线扫描分析（图4C）。

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图4. 3D和4D图像的呈现和分析。答：在XYZ模式图像中选择感兴趣的区域（左面板）以制作新的裁剪3D图像。裁剪后的3D图像以3D不透明度模式以两个不同的角度显示（右侧2个面板）。货物（Axl2-GFP，绿色）在质膜本地化（箭头）和内标有双方的高尔基小脑（虚线圆）顺式- （Mnn9-mCherry的，红色）和反式-Golgi（SYS1-IRFP，蓝E）标记。B.显示了4D图像（延时3D反卷积图像）（左侧面板）（另请参见视频1）。Mnn9-mCherry信号消失的帧设为0 s。右侧显示了每个时间点的Axl2-GFP（货物，绿色），Mnn9-mCherry（顺式，红色）和Sys1-iRFP（反式，蓝色）的相对荧光强度。观察到高尔基水箱与货物成熟（虚线圆圈）。在开始时（-25 s），水箱用顺式- 高尔基标记（Mnn9-mcherry，红色）和反式- 高尔基标记（Sys1-iRFP，蓝色）标记。它丢失了Mnn9-mcherry信号并获得Sys1-iRFP信号，然后仅在-5.6 s时用Sys1-iRFP标记，表明它已成熟为反式-Golgi。最后，由于Sys1-iRFP信号在11.2 s时消失，因此该水箱成熟到了TGN。注意，显示3D图像的角度对于在一个水箱中获得正确的荧光强度很重要。仅凭顶视图分析随时间变化的荧光强度可能会获得不正确的红色荧光值，因为左侧面板中的箭头指示了另一个顺式储水池，该储水池正好位于分析储水池的正下方。C.对3D解卷积的图像进行线扫描分析（上图）。显示了-16.8 s时的3D解卷积图像（合并图像，Axl2-GFP，Mnn9-mCherry和Sys1-iRFP）（上图）。降低图显示相对FL Axl2-GFP（货物，绿色），Mnn9-mCherry的（的uorescence强度顺，红色），SYS1-IRFP（反式沿熟化延髓池白色箭头，蓝色）。Mnn9-mCherry和Sys1-iRFP显示在水箱内分离的定位。货物位于两个地区。

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视频1. 从两个不同的角度看，高尔基水箱的成熟与货物

检查并纠正3个摄像机中XYZ位置的不对准
在观察表达3种荧光蛋白的酵母细胞之前，我们总是通过以下方法检查和纠正3台摄像机中XYZ位置的错位。

通过使用3个摄像机的针孔图像检查并校正XY位置中的未对准

停止旋转共聚焦扫描仪的旋转磁盘。
将卤素灯光源发出的微弱光照射到物镜上。
用3台摄像机获取穿过针孔的卤素灯图像。
注意：由于3个图像增强器中的放大增益是独立控制的，因此我们可以在3个相机中获取几乎相同强度的图像。

调整定制光谱仪的分色镜和反射镜的角度，以校正3个摄像机图像的XY位置。

通过使用Volocity 的荧光蛋白渗漏信号检查并纠正3台摄像机中XYZ位置的未对准

准备表达GFP的酵母细胞（例如，表达Sec13-GFP的酵母细胞，其在周围ER和核膜周围显示虚线信号）。
用473 nm激光在高功率下激发GFP，并通过调节2个图像增强器的放大增益，用2个用于绿色和红色荧光的相机同时获取GFP的发射信号和穿通信号。在两个专用于绿色和红色荧光的摄像机中，检查发射信号和GFP点的穿通信号在XYZ位置上的失准。
以相同的方式，用两个专用于红色和红外荧光的摄像机获取红色荧光的发射信号和渗漏信号（例如，表达Sec13-mCherry的酵母细胞），然后检查未对准情况。
从“在操作中新建”菜单中选择“配准校正”，以使用3通道XYZ位置的未对准来创建新的配准校正参数。
从“工具”菜单中选择“正确配准”，然后使用配准校正参数在3个通道中校正XYZ位置中的未对准。

菜谱

MCD琼脂板
不含氨基酸的0.67％酵母氮碱基

0.5％酪蛋白氨基酸

2％葡萄糖

2％琼脂

在450毫升蒸馏水中混合酵母氮基3.4克，维生素测定酪蛋白氨基酸2.5克和琼脂10 克
在120 °C下高压灭菌20分钟
加入50毫升的20 ％葡萄糖和5毫升适当的氨基酸补充剂
将培养基倒入细胞培养皿中（约20 ml /皿）
在使用前将板固化2-3天，并保存在4 °C下
MCD媒体
不含氨基酸的0.67％酵母氮碱基

0.5％酪蛋白氨基酸

2％葡萄糖

在450毫升蒸馏水中混合酵母氮基3.4克和维生素测定酪蛋白氨基酸2.5 克
甲DD50毫升20 ％葡萄糖和5毫升的适当氨基酸补充剂
室温保存

Acknowledg 发言：

这项工作得到了作者的JSPS资助（KK和AN的JP25221103，JP17H06420和JP18H05275）的支持。该协议改编自黑川等人。（2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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