材料和试剂

1. 样品收集管

血液
体积小：K3 EDTA 微型沸石（Sarstedt ，目录号：NC9990563）

大容量：EDTA 单体印刷机（Sarstedt ，目录号：NC9453456）

尿液或唾液
小体积：1.5毫升Eppendorf管（Eppendorf，目录号022363204）

大容量：猎鹰管（15毫升）（Fisher Scientific，目录号：14-959-53A）

2. 96孔PCR板（Thermo Fisher Scientific，目录号：N8010560）

3. 用于96孔PCR板的粘性PCR板箔（Bio-Rad，目录号：1814030）

4. 薄壁Qubit分析管（0.5 ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：Q32856）或黑白平底96孔板（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3925 / CLS3922）

5. 底漆（储存在-20 °C 的冰箱中）

人核DNA（F：5 ' -gcttctgacacaactgtgttc-3 ' ，R 5 ' -caccaacttcatccacgttca-3 ' ）
人类线粒体DNA（F：5 ' -cataaaaacccaatccacatca-3 ' ，R 5 ' -gaggggtggctttggagt-3 ' ）
6. 96％乙醇（Fisher Scientific，目录号：BP8202500）

7. 密理博水

8. Qubit dsDNA HS检测试剂盒（Thermo F isher Scientific，目录号：Q32854）（在4 °C的冰箱中存储，在室温下使用）

9. QIAmp DNA Blood微型试剂盒（Qiagen，目录号：51104）（在室温下保存，重组后的蛋白酶在4 °C 的冰箱中保存）

10. Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix （Bio - Rad实验室，目录号：1725270）（存储在-20 °C 的冰箱中）

11. 琼脂糖分子等级（西格玛奥德里奇，目录号：05077）

12. TAE缓冲液（50x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：B49）

13. 加载染料（存储在4 °C的冰箱中）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）

14. GoodView 核酸染色剂（SBS Genetech ，目录号：HGV-2）（存储在4 °C的冰箱中）

设备

带有适用于猎鹰管的转子和适用于Eppendorf管的转子的离心机
实时PCR循环仪（QuantStudio TM 3实时PCR系统，96孔，Thermo Fisher Scientific）
Qubit 3.0荧光计或DeNovix QFX荧光计或荧光板读取器（Synergy H1，BioTek ）
Vortex Genie 2（科学产业）
多通道Eppendorf移液器（8通道，30-300 µl）（Eppendorf）
电泳法
紫外线透照仪（UVP）

软件

Office Excel（Microsoft）或任何等效
实时PCR分析软件
Gen5（Synergy H1阅读器软件；BioTek ；可在此处获得）

程序

样品处理（例如血液，尿液，唾液，其他体液）
将用于测量细胞外DNA的样品收集到适当的试管中。在装有EDTA的试管（紫色）中收集血液。将尿液和唾液收集到无菌Falcon管或Eppendorf管中。
笔记：

钍样品e处理是非常重要的，是技术变化的主要来源。血清收集管会引起血液凝结，并在凝血过程中使DNA从血细胞中释放出来。含肝素的试管可防止凝血，但不抑制可能能够裂解细胞外DNA的脱氧核糖核酸酶的活性。EDTA抑制脱氧核糖核酸酶的活性，并且是优选的抗凝剂。抗凝剂与血液的比例应保持一致。从人类先证者采集血液很容易做到，但是从实验动物采集血液时可能很难做到。
溶血会增加血浆中细胞外DNA的浓度。溶血样品应从实验的最终分析中排除。可以收集刺激的和未刺激的唾液以评估细胞外DNA的浓度。唾液应在相同的时间（例如10分钟）内收集以评估唾液产生。pH低的尿液可能会降解不受保护的细胞外DNA。
在4°C下以1,600 xg 离心样品10分钟。
注意：样品收集后应立即进行离心。离心前请勿冷冻样品，以防止其他细胞裂解。与使用冷冻样品相比，处理新鲜样品可能会导致分离出的DNA不同。理想情况下，样品应未经冷冻处理。当分析新鲜样品时，长时间保存在冰箱或室温下也会影响DNA产量。样品的冷冻和解冻可能会影响包含DNA的囊泡的完整性以及细胞外DNA与蛋白质的复合物。此外，在分离之前，应将样品加热至37°C，以降低粘度并提高移液精度。

将上清液吸移到新的Eppendorf管中。注意不要将细胞放在管底部的沉淀中。
注意：第一次离心后，可能很难吸取某些类型的样品。需要注意的是，血浆可能无法完全分离，并且颗粒容易受到干扰。同样，某些唾液样本比其他样本更粘。可以通过移液少量液体（50 µl ）并控制机械移液器吸取液体的速度来避免扰动颗粒的问题。这对于低体积样品尤其如此，例如，小鼠血液或唾液。

离心机样品在16，000 ×g下在4℃下10分钟。离心除去样品中较大的囊泡和凋亡小体。
第二次离心后，试管底部应有一个小的沉淀。移液到新管中时，请小心不要取下沉淀物。小心地将上清液吸移到新管中。
可以使用各种市售试剂盒将上清液用于分离细胞外DNA。

细胞外DNA的分离（QIAmp DNA Blood mini试剂盒制造商规程）
根据制造商的规程中的说明进行隔离。
在干净的试管底部吸取20 µl蛋白酶。
加入200微升样品。可以根据样品材料调节音量。通常，尿液含有很少的细胞外DNA。样品量可以增加。
加入200 µl AL缓冲液。
脉冲涡旋样品15 s。短暂离心以除去盖子上的液滴。
在56 °C下孵育样品10分钟。再次简短地离心样品。
加入200 µl 96％乙醇。脉冲涡流样本持续15 s。
再次简短地离心所有样品以除去盖子上的液滴。
将样品溶液吸移到DNA Blood mini试剂盒中随附的离心柱中。
以6000 x g 的速度离心样品60 s。
丢弃柱下方小水箱中的流过液。
加入500 µl AW1溶液，以洗涤与柱结合的DNA。
离心6 ，000 ×g离心60秒。再次，丢弃流经。
加入500 µl AW1溶液。
离心机以最大速度，高达20 ，000 ×g离心3分钟。
丢弃流量，并更换新的色谱柱收集管。再次离心以除去柱膜上的残留洗涤缓冲液。
注意：我们强烈建议您进行可选的离心分离（步骤B 16）。这有助于从色谱柱上除去残留的缓冲液和乙醇。

将色谱柱转移到Eppendorf管中，并向色谱柱中加入Millipore水以洗脱DNA。为了浓缩样品中发现的少量细胞外DNA，可使用50 µl至100 µl的洗脱液。
注意：细胞外DNA的浓度通常很低。因此，在样品处理和DNA分离过程中引入的污染很容易影响结果。为了评估潜在的污染，还应从阴性对照（例如微孔水）中分离DNA 作为样品之一。如果使用灵敏荧光测定法，分离后甚至在阴性对照中也可能有痕迹的载体DNA。PCR不受此DNA痕迹的影响。为了减少污染源，如果样品量低于200 µl，则不应按照原始DNA分离规程的要求添加PBS。

离心管在列6 ，000 ×g离心60秒。
丢弃色谱柱后，试管中将含有分离出的细胞外DNA。

使用单个试管对总细胞外DNA进行定量（Qubit dsDNA HS检测试剂盒，其他荧光定量选项）
按照制造商的规程准备工作溶液并将其与样品混合。工作溶液可以由制造商预先制备，也可以通过混合缓冲液和荧光染料（均由制造商提供）来制备。这取决于所使用的套件。
避免在光线下长时间存放。涡旋试管，但避免在涡旋后立即进行测量。让样品静置至少一分钟。
注意：涡旋后不应该立即测量样品，因为这会导致荧光的随机峰值。重要的是要充分混合试管，避免液滴粘在盖子上。可以通过轻轻摇晃除去水滴。

对于测量，可以使用Qubit荧光计或DeNovix 系统。在阅读器上选择正确的设置。在阅读器上选择用于测量的正确工具包。
衡量标准。这些通常由套件提供。一种标准品是阴性对照（缓冲液或蒸馏水），另一种是含有已知浓度的DNA的高标准品。
测量样品中的荧光并记录相对荧光单位（RFU）。
测量样品3次，以避免ERRO RS（Ñ OTE 一个）。根据原始RFU值的校准曲线计算浓度。根据校正曲线，使用的稀释液和洗脱体积重新计算样品中DNA的浓度（注b ）。
ñ OTES：

测量DNA浓度的机器很少会显示错误。但是，在某些情况下，长时间保存后，制造商提供的高标准DNA可能会降解。重要的是要注意在使用机器和套件时始终获得的RFU。同样，重复使用时，空白可能会被污染。可以通过将标准等分来避免。
以与计算用于蛋白质定量的校准曲线相同的方式计算校准曲线。在这种情况下，仅使用两个校准点。荧光与DNA浓度成线性关系。线性回归用于基于RFU重新计算DNA浓度。
有关测量灵敏度的确定，请参阅以下注释。
笔记：

可以通过确定检测限和定量限来测试试剂盒和测量的灵敏度。在大多数情况下，试剂盒制造商已根据荧光和DNA具有线性关系的建议范围提供了这些试剂。通过将空白的标准偏差乘以3来计算检测极限，通过将空白的标准偏差乘以10来计算定量极限。这也适用于使用酶标仪的测试灵敏度（步骤D）。
如果我们想测试它的灵敏度进一步，我们可以例如从DNA与起始的1浓度制备，五10倍稀释，000纳克/毫升。这将为我们提供100 ng / ml，10 ng / ml，1 ng / ml，0.1 ng / ml和0.01 ng / ml的试管。如果我们使用Qubit dsDNA HS分析试剂盒，我们将能够测量更高的RFU，这要感谢前两次稀释的空白。浓度为1 ng / ml，0.1 ng / ml和0.01 ng / ml的DNA稀释液将处于空白水平。

使用酶标仪定量总细胞外DNA
根据制造商的协议准备工作解决方案。
根据DNA标准液制备校准曲线，并首先测试可用的荧光板读数器的灵敏度，因为不同仪器之间的差异可能很大。如果需要，使用白色或黑色微孔板调节灵敏度。
注意：如果测量的细胞外DNA浓度非常低，请使用包括荧光增强剂的更敏感的试剂盒，例如DeNovix 超高灵敏度试剂盒或AccuBlue 高灵敏度dsDNA试剂盒。如果要测量高浓度（例如唾液中）的细胞外DNA，可以使用不太敏感的定量方法。

将样品添加到工作溶液中，并用多通道移液器上下吸移几次，以形成气泡。
注意：缓慢小心地上下搅动样品有助于确保不会形成气泡。避免移液器吸头吸入空气可以防止气泡。将工作溶液移入孔中时，可以使用反向移液或理想的分配。

使用荧光板读数器测量荧光。激发波长为485 nm，发射波长为530 nm。测量每个板至少三遍，以检查每个孔中荧光的稳定性。

使用实时PCR定量核和线粒体细胞外DNA
为所有计划的反应准备PCR预混液。始终包括正面和负面的控制。
注意：阳性对照是已知浓度的线粒体DNA任一核的模板。这些可以从分离和PCR反应中获得。使用荧光定量方法，例如Qubit dsDNA HS分析试剂盒确定浓度。可以从分离的样品中制备系列稀释液。可以对纯化的PCR产物进行测序以进一步证明其特异性，并且可以用作校准曲线的标准。根据样品范围，所得的校准应由2倍至10倍的稀释液组成，应通过分析多个样品预先确定。DNA的阴性对照和稀释剂是分子级Millipore水。

用吸管将PCR主混合物，引物和样品置于通风橱中，以免污染。
注意：如果需要，可以减少PCR反应的体积。最多可以减少15到10 µl。不同的实时预混液可用于定量。需要测定的标准化。我们已经提到了我们已经使用的两种主要混合物，它们可以用于这种类型的分析。

针对核和线粒体DNA中的单拷贝基因运行实时PCR。建议的人类细胞外DNA引物序列可在材料部分找到。注意核DNA中存在线粒体序列。
检查上凝胶电泳条带的存在和不存在，以确定PCR（的特异性Ñ OTE 一个）。故障排除选项中讨论Ñ OTES b 和下面C 。
笔记：

使用实时PCR定量细胞外DNA是一种灵敏而有效的方法。分离过程中引入的污染会影响最终测得的细胞外DNA浓度。理想情况下，应在相同条件下同时分离所有样品。实时PCR应同时在所有样品上进行。使用一式三份可以帮助获得可重复的结果。
有时需要进一步的故障排除才能获得最佳结果。反应的特异性和敏感性至关重要。通常，从体液中分离出的DNA只有很少的拷贝。大多数DNA位于细胞或囊泡中，可通过离心去除。游离DNA片段通常很短。可以基于实时PCR和凝胶电泳的解链曲线评估反应的特异性。如果存在引物二聚体或熔解曲线没有特征峰，则需要调整反应。这通常是通过调整退火温度来完成的。
可以与步骤C7注解b中所述的荧光测量类似地确定反应的灵敏度。实时PCR可以检测低浓度的DNA，非常灵敏。用这种方法可以检测到少量DNA拷贝。

致谢

斯洛伐克研究与发展局（APVV-16-0273）和斯洛伐克共和国教育部（VEGA 1/0092/17）的资助为作者提供了支持。用于样品处理的方案基于Dennis Lo及其同事开发的广泛使用的方法，例如在Chiu 等人（2007年）中描述的方法。（2003）。

利益争夺

没有利益冲突。

伦理

所有描述的样品收集程序均已通过位于布拉迪斯拉发的夸美纽斯大学分子生物医学研究所的伦理委员会批准（ro-536 / 18-221 / 3; 01/07 / 2018-01 / 05/2020 ）。

参考文献

詹森，MP，的Emal ，D.，特斯克，GJ，Dessing ，MC，Florquin ，S。和罗洛夫斯，JJ（2017）。细胞外DNA的释放通过血小板活化和嗜中性粒细胞外陷阱的形成影响肾缺血再灌注损伤。肾脏国际杂志91（2）：352-364。
Lahiri ，DK和Schnabel，B。（1993）。通过快速方法从人血液样本中分离DNA：MgCl 2 ，EDTA，储存时间和温度对DNA产量和质量的影响。Biochem Genet 31（7-8）：321-328。
Laukov á ，L.，Konecna ，B.，Babickova ，J.，Wagnerova ，A.，Meliskova ，V.，从Vlkova ，B。和Celec，P。（2017）。外源性脱氧核糖核酸酶在脓毒症的小鼠模型中具有保护作用。Biomed Pharmacother 93：8-16。
Lee，TH，Montalvo，L.，Chrebtow ，V. and Busch，MP（2001）。血浆和血清样品中的基因组DNA定量：血清中的基因组DNA浓度比血浆中高。输血41（2）：276-282。
P. Mandel和P.Métais（1948）。血浆血红素核糖核酸。整理了《生物学与生物学》杂志的《生子研究会》（Rendus des Seances de la Societe de Biologie et de ses Filiales）。142（3-4）：241-243。
Poon，LL和Lo，YM（2001）。在母体血浆中循环胎儿DNA。Clin Chim Acta 313（1-2）：151-155。
Sun K.，Jiang P.，Wong，AIC，Cheng，YKY，Cheng，SH，Zhang，H.，Chan，KCA，Leung，TY，Chiu，RWK and Lo，YMD（2018）。母体血浆DNA中带有大小标签的优选末端阐明了产生机理，并在无创产前检测中显示出实用性。PROC国家科科学院科学USA 115（22）：E5106-E5114。
Vokálová ，L.，Laukova ，L.，Conka ，J.，Meliskova ，V.，Borbelyova ，V.，Babickova ，J.，Tothova ，L.，Hodosy ，J.，Vlkova ，B.和Celec，P.（ 2017）。脱氧核糖核酸酶可部分缓解硫代乙酰胺引起的肝肾损伤。牛J 生理学Gastrointest 肝脏生理学312（5）：G457-G463。