材料和试剂

1. 针头（标准储存温度：2588g，单针，2588g）

2. 无菌绷带，18“x 26”（McKesson Minor Procedure drape，产品编号：25-517），室温下储存

3. TIME14（存储在温度为31M的磁带）目录编号为31MED

4. 注射器（1 ml结核菌素注射器常规针头）（MonojectTM，目录号：8881501400，室温储存

5. 注射器（3 ml Luer Lock注射器）（MonojectTM，目录号：8881513934），室温下储存

6. 无菌手套（合成外科手套，无粉末，Confiderm®SPT），室温储存

7. 纱布海绵（无纺布纱布，2英寸。x 2英寸。[5.08 cm x 5.08 cm]）（AVANT纱布®，目录号：25223），室温下储存

8. 棉头敷贴器（非无菌棉头喷头，长度：6“）（SolonCare®，目录号：71704），室温下储存

9. 聚苯乙烯称量盘（称盘PS，1 5/8“x 1 5/8”x 5/16“[小]）（Fisherbrand®，目录号：02-204A），室温下储存

10. 室温下储存的铝箔（克拉克食品服务公司，目录号：CF 1851）

11. 外科用3-0丝（黑色编织丝，3-0 USP）（外科专用品，目录号：SP117），室温下储存

12. 外科缝合器（反射皮肤闭合系统，Clip Applyer，7 mm）（Agnthos，目录号：204-100）

13. 成年雄性Sprague-Dawley大鼠（250-275克；大约50天大，马萨诸塞州威尔明顿查尔斯河实验室）

14. 脱氧皮质酮醋酸酯，DOCA（Sigma-Aldrich，目录号：D7000-5G，CAS:56-47-3），室温保存

15. 一袋生理盐水（氯化钠0.9%袋装注射用[1000 ml]）（巴克斯特，目录号：0338-9543-06），室温下储存

16. 70%异丙醇（473 ml）（Medline Industries，目录号：53329-800-06），室温下储存

17. 碘消毒液（聚维酮碘擦剂，960毫升）（预防护理，目录号：50009-110-32），室温下储存

18. 消毒皂（2%葡萄糖酸氯己定溶液防腐剂（Scrub-StatTM ECOLAB®，目录号：47593-463-31），室温下储存

19. 肝素50单位/ml（肝素钠注射液USP，50单位USP/ml）（B.Braun Medical Inc.，目录号：0264-9577-10），室温下储存

20. 异氟烷（仅限Rx，吸入用液体，250毫升）（吡酰胺企业有限公司，目录号6679401725），室温储存。

21. 酮洛芬（酮芬，100 mg/ml）（Zoetis公司，目录号：140269），室温储存

22. 硫酸庆大霉素，200-395[100 mg/ml]（ANADA，目录号：1398563304），室温下储存

23阿托品（硫酸注射液，USP[8 mg/20 ml]，目录号：0641600601）23阿托品（硫酸注射液，USP[8 mg/20 ml]，目录号：0641600601），室温保存

24. 戊巴比妥（致命加溶液CII[390 mg/kg，250 ml，RXV CII[2N]），室温下储存

25. 盐酸丁丙诺啡（注射用CIII[0.3 mg/ml]）（丁丙诺啡®，目录号：12496-0757-5），储存于20°C至25°C

26. 润滑眼膏（主要药物[3.5 g]）（Lubrifreshm P.M.，目录号：0904-5168-38），室温下储存

27. Sylgard 184硅橡胶弹性体（以流动液体形式供应的双组分硅橡胶，Sylgard 184®[500 g]）（道康宁，目录号：2404019862），使用范围为-45°C至200°C

28. 标准Rat Chow（2018 18%蛋白质啮齿类食物，Teklad Global Diets®）（Envigo，目录号：44220），室温下储存

29. 0.1%NaCl粉末食品（含0.1%氯溴酸钠的成熟啮齿类动物饲料，开放源代码DietsTM，研究性饲料）（新不伦瑞克，目录号：D17020M），储存于4°C

30. 氯化钠，NaCl（氯化钠认证ACS晶体，500 g）（费希尔化学，目录号：S271-500），室温下储存

31. 纤维贴片（PA-C40纤维素贴片，数据科学国际，明尼苏达州圣保罗）

32. VetBond外科粘合剂（组织粘合剂，3毫升瓶装，带MSDS）（3M VetbondTM，目录号：1469SB），室温储存

33. 0.9%氯化钠饮用溶液（见配方）

设备

1. 仪器（图2）

微型解剖牵开器（A1和A4）

长止血钳（A2）

持针器（A3）

弯形止血钳（A5）

显微解剖直形小剪刀（A6）

外科剪刀（A7、A8和A14）

适用于9毫米（A9）的自动夹持器

带10号刀片的手术刀（A10）

手术刀柄（A11）

针架（A12）

微动脉瘤夹（A13）

镊子（A15和A17）

中型止血钳（A16）

带齿解剖钳（A18）

微型解剖钳（A19）

小抹刀（B1）

称量盘（B2）

图2。外科手术中使用的器械（A）和DOCA微丸的制备（B）

2. 辅助加热（加热垫，18“x 26”[46 cm x 66 cm]）（MultPad，史崔克，产品编号：TP26E），室温下储存

3. 脱毛剪（Oster®Golden A5®，可拆卸刀片，120伏交流电，45瓦；[尺寸40]）

4. 代谢笼（Nalgene代谢笼）（Ancare，目录号：650-0100）

5. 单笼支架（Ancare，Bellmore，NY。更多信息：www.ancare.com网站)

6. 垂直代谢笼架（Ancare，Bellmore，NY。更多信息：www.ancare.com网站)

7. 异氟醚汽化器（汽化麻醉汽化器，SKU:20010，NY）（VapomaticTM，目录号：2200）

8. 兽医麻醉机（Am Bickford麻醉机，目录号：61020；SKU:61020B，NY）

9. 鼠诱导室（诱导室，1升3.75“W x 4.50”D x 3.75“H，专为单个老鼠或小型老鼠设计）（VetEquip®，目录号：941443）

10. 热疗泵（T/Pump®，史崔克医疗，型号：TP 700）

11. PA-C40变送器（TA11PA-C40，Data Sciences International，目录号：270-0040-008），室温储存

12. AM收音机（FM/AM，DC:3V R6尺寸AA x 2 Batt或同等型号，Sony®，型号：ICF:S10MK2）

13. 遥测接收器（RPC-l，DSITM，目录号：272-6001）

14. 数据交换矩阵TM（美国明尼苏达州圣保罗市DSITM）

15. 环境压力基准（DSITM，型号：APR-1）

16. IBM计算机

软件

1. Dataquest IV软件（DSITM，www.dataquest.io)

2. Microsoft Excel

3. Sigma图（Sigma Plot 9.0，技术制图标准，SYSTAL，www.systal.com网站)

4. 注意图表(www.mindthegraph.com网站)

程序

A、单侧肾切除术和传送器植入术

手术所用的器械和其他材料必须是无菌的。有几种消毒方法。我们建议对所有仪器进行蒸汽灭菌（高压灭菌）。大鼠应称重，并根据个体体重给予麻醉剂和药物剂量。

B、麻醉和术前程序

1. 在手术前一天晚上（大约8小时前）禁食。

2. 将大鼠置于一个诱导室中，异氟醚以100%氧气输送。诱导必须每5分钟从0.5%的异氟醚开始，直到气体诱导达到5%（更多详情见参考文献9）。

3. 把眼膏涂在眼睛上润滑。

4. 当动物到达麻醉手术平面后，从手术室取出，放在加热垫上（确保有循环的温水），用胶带固定大鼠，并将其置于背部卧位。

5. 把老鼠的舌头拉到嘴边，保持呼吸道畅通。

6. 维持深麻醉状态使用鼻锥给药异氟醚在氧气中2%。

7. 术前给予阿托品（0.5 mg/kg；肌内）、庆大霉素（6 mg/kg；皮下）和酮洛芬（2.5 mg/kg；皮下）。

8. 在手术和术后恢复期间，将所有大鼠放在加热垫上。

9. 一旦完全麻醉动物，其特征是手指对远端尾部的夹持压力没有反应，将大鼠剃毛（夹在手术所需的区域）（图3），并用碘消毒液擦洗手术部位3次，然后是机构动物护理和使用委员会（IACUC）和研究动物资源（RAR）推荐的70%酒精。

图3。大鼠手术准备示意图。需要剃光的区域（A）。切口（B）和腹腔开口（C）。

注：对每只大鼠同时进行两种手术。

10. 使用无菌手套，将手术区域覆盖起来，防止污染消毒部位，在窗帘上挖一个洞。在多个手术的情况下，建议使用一套器械，以及在一套和另一套清洁、无菌的器械之间进行不超过6只动物的手术。此外，必须戴上新的无菌手套。

11. 手术前约10分钟，打开发射器包装，记录序列号，并确保设备已被植入动物识别。

C、手术（图4）

单侧肾切除术（Zwemer，1999年提供了本程序更详细的分步说明）：

图4。手术程序和实验时间表示意图。单侧肾切除术（A）。压力变送器植入（B）。在DOCA或假颗粒植入前约19天，对每只大鼠同时进行两次手术。手术后提供14天的恢复期，然后再进行下一个手术，允许与单侧肾切除术相关的代偿性肾肥大。在这个恢复期，动物被关在正常的笼子里，可以随意享用标准的老鼠食物和水。恢复2周后，将所有大鼠转移到单独的代谢笼中，提供0.1%NaCl饮食和0.9%NaCl随意饮用溶液。每天，在5个对照日内，测量水和食物的摄入量以及尿量、血压和心率。在这个控制期之后，进行手术（C）皮下植入DOCA或假颗粒。在DOCA或假颗粒植入后的21天内，每天测量血压、心率、食物和水的摄入量和尿量。实验结束后，用致死剂量的戊巴比妥钠对大鼠进行深度安乐死。

1. 用10号无菌手术刀从腹壁轻轻切开皮肤，在中线4-6厘米处切开。

2. 用锋利的剪刀沿着中线切开腹部肌肉，露出腹部的内容物（胃、小肠、大肠、脾脏、胰腺和肠系膜动静脉）。

3. 为了获得更好的视觉效果，可以通过轻轻拉动内脏并将其从腹部释放出来并将其推到动物右侧来暴露肾脏。

4. 用两个韧带确定并分离肾血供。用无菌3-0丝线缝合肾门处的动静脉。右输尿管与肾门相连，也应结扎。用虹膜剪（图2，A8仪器）靠近门部切断血管和输尿管。

5. 小心地隔离右肾周围的脂肪和结缔组织，以避免损伤邻近的肾上腺，并切除肾脏。

发射器植入（图5；参考文献4和Cesarovic等人，2011提供了本程序更详细的分步说明）：

图5。发射器植入示意图。导管被放置在腹主动脉肾动脉和髂分叉之间。遥测装置固定在腹壁闭合装置上（参考文献4修改）。

6. 使用湿润的棉花敷贴器，轻轻地分开肠道，使位于背侧体壁的降主动脉可视化。用湿润的纱布海绵收缩肠道。

7. 下一步，必须观察降主动脉。使用无菌棉签，仔细彻底地从主动脉剥离周围的脂肪和结缔组织。

8. 导管插入术前，清除主动脉腹表面多余的组织。这保证了良好的止血效果。

9. 一旦一切准备就绪，将主动脉夹在肾动脉的远端（图2，A13仪器），用弯曲的21号针在钳夹的远端（就在远端主动脉分叉处的近端）进行穿刺。

注意:此时，导管的时间到了由于夹持可能导致缺血，因此放置受限。

10. 将遥测设备导管（Data Science International，St.Paul，MN）的尖端插入腹主动脉，并引导上游（使用钳子A17），颅面约1 cm。用一小滴组织粘合剂（Vetbond外科粘合剂）和一个外科贴片（Data Science International）固定导管并止血。

11. 等待大约30秒，使粘合剂粘合，然后拆下卡箍。

12. 在取下夹钳后，可以验证发射机在主动脉中的位置，因为该设备发射AM射频，并且可以在发射机机身附近的小型AM收音机上听到（视频1）。

视频1。在主动脉中的传送器位置

13. 将遥测装置主体放入腹腔，用无菌3-0丝线缝合在腹部肌肉组织中。

14. 轻轻更换大鼠腹腔内容物，用无菌3-0丝线分层关闭剖腹术（分别封闭腹部肌肉和皮肤）。

15. 手术完成后，将动物放在单独的笼子里，笼子的一半放在加热垫上，直到老鼠醒来。

16. 术后约7-10分钟用小剪刀将缝线和缝合线取下。

术后治疗：

17. 给予丁丙诺啡3天Bis（B.I.D；0.05-0.1mg/kg；皮下注射），并随意获得正常大鼠食物和水。

18. 每天监测大鼠是否有健康的BARG信号（明亮、警觉、反应灵敏和整洁）。如果动物没有出现BARG症状，建议联系兽医，评估它们的状况，以及它们是否可以在实验中使用。

19. 在下一个手术前，给大约14天的时间在标准的笼子里恢复，考虑到与单侧肾切除相关的代偿性肾肥大。

代谢笼（图6）：每日水、食物摄入量和尿量的评估

图6。个体代谢笼（Nalgene Nunc，纽约州罗切斯特市）。啮齿类动物代谢笼是一种重要的研究工具，有必要测量水/食物的摄入量、粪便和尿液输出量。一般来说，所有部件都是可拆卸和可清洗的。水和尿液（1和2）以及尿液（3）的容器是圆柱形塑料管，分别用于精确测量消耗量和输出量。食物储存在一个塑料抽屉（4）中，这样可以很容易地滑动而不影响动物。进料室（5），位于笼外。收集漏斗和分离锥（6）提供粪便和尿液的完全分离（更多信息，我们建议咨询Ancare网站）。

20. 恢复2周后，将所有大鼠单独关在代谢笼中（Nalgene Nunc，Rochester，NY），提供0.1%NaCl饮食和0.9%NaCl饮用液。

21. 在此期间测量24小时的水和食物摄入量。这些测量方法是将提供的水/食物量减去第二天同时剩余的水/食物量。

22. 要测量尿量，请记下笼子下面特定量筒中的容量。

23. 计算钠摄入量为从生理盐水摄入的钠（0.154 meq/ml）加上食物摄入和食物中钠含量的乘积（0.1%氯化钠，357 0.0175 mmol/g）。

24. 计算每日钠和水的平衡，作为钠和水的摄入量和尿排泄量的差值。

D、 DOCA或假颗粒植入手术

手术植入前至少72小时制作DOCA和假硅胶植入物。

颗粒制备

1. 称取100 mg DOCA于一个小型称重船中（见图2；B2）。在一周内重复上述步骤。

2. 将2ml Sylgard 184硅胶的A部分加入3 ml注射器中，并将预先称重的DOCA加入称重船中。将抹刀彻底搅拌30-45秒。确保粉碎任何小团块，因为均匀性对颗粒质量极为重要*。

N注意：*这是制备微丸的关键步骤。如果这些吸收不均匀速率不一致，结果可能因变异性而混淆。

3. 从硅胶盒中提取0.2 ml固化剂，放入1 ml注射器中，并将0.2 ml加入硅胶混合物中。再次充分搅拌约30-45秒。

4. 用预先标记的铝箔（即100毫克DOCA和date）覆盖，并在室温下放置24小时。

5. 让DOCA植入物在室温下固化24小时，然后在4°C下冷藏，直到外科植入当天。

6. 假颗粒的制备方法与上述相同，无需添加DOCA。

植入：这个程序必须在2周恢复后的5个对照日后进行周期（见图4）。

7. 手术前，用无菌手术刀将DOCA颗粒切成约1-2 mm3的碎片，并将内容物转移到大的、乙醇清洁的抹刀上。

8. 麻醉所有大鼠并提供上述术前治疗和消毒程序后，植入DOCA或假颗粒。

9. 刮胡子并清洁左侧。做一个皮肤切口（~3-4厘米），并用梅奥剪刀形成皮下口袋。

10. 将抹刀插入开口，并将小球（每只老鼠一只）推入口袋。

11. 用吻合器或缝线封闭手术部位。

12. 如上所述，手术后将动物关在单独的笼子里，笼子的一半必须放在加热垫上，直到它们麻醉归来。

注意：小球很可能会粘在一起或堆积起来，所以一定要用手指压平并分散一次手术口关闭。

13. 大鼠恢复后回到家中笼内，术后给予酮洛芬（2.5mg/kg IP）镇痛，每日1次，连续3天。继续免费提供0.1%氯化钠粉末食品和0.9%氯化钠饮用溶液。

14. 将大鼠单独关在各自的代谢笼中，将其放置在接收器上（设置DSI监测设备[图1]，500 Hz，10 s/min），并在DOCA植入后21天内每天测量平均动脉压（MAP）和心率（HR）、食物和水的摄入量和尿量。

注意：将动物放在接收器上的单独代谢笼中后，它是重要的是等待15-25分钟，心脏参数恢复到基线水平。

安乐死

15. 实验结束后，用致死剂量的戊巴比妥钠（65mg/kg，腹腔内）对大鼠进行深度安乐死。

数据分析

收集24小时平均血压、心率、钠摄入量、钠输出量、水摄入量和尿量。结果以平均数±标准差分法（means±S.E.）报告。采用双向方差分析结合学生纽曼-克尔斯检验进行组间比较。P<0.05时，差异被认为是显著的（Collister等人，2018年）。

食谱

1. 0.9%NaCl饮用液

a、在1000毫升蒸馏水中溶解9克氯化钠

b、搅拌至完全溶解

c、在室温下储存溶液

致谢

支持这篇论文的原始研究，“穹窿下器官损伤对盐皮质盐性高血压发展的影响”和“大鼠卵巢过度移植明显减轻慢性DOCA盐性高血压”，由国立卫生研究院国家心肺与血液研究所（HL64178）和明尼苏达大学资助107426资助J.P.Collister。

相互竞争的利益

作者声明本文不涉及任何利益冲突（财务或任何其他方面）。

伦理学

所述的所有程序均由机构动物护理和使用委员会批准和监控（IACUC协议编号1509-32991A-OVLT在DOCA高血压中的作用于2015年12月21日至2018年12月20日期间批准）。

工具书类

1. Basting，T.和Lazartigues，E.（2017年）。DOCA盐性高血压：最新进展。高血压报告19（4）：32。

2. Cesarovic，N.，Jirkof，P.，Rettich，A.和Arras，M.（2011年）。植入无线遥测发射器，在自由活动的实验鼠中产生心电图、心率、核心体温和活动的数据。视觉实验杂志（57）：e3260。

3. Collister，J.P.，Nahey，D.B.，Hartson，R.，Wiedmeyer，C.E.，Banek，C.T.和Osborn，J.W.（2018年）。OVLT损伤可明显减轻大鼠慢性DOCA盐性高血压。《美国生理学杂志》生理调节整合器生理学315（3）：R568-R575。

4. DSI®数据科学国际。“PA装置手术手册”。（为客户印刷）

5. DSI®数据科学国际。“遥测信息指南”。（为客户印刷）

6. Grobe，J.L.，Buehrer，B.A.，Hilzendeger，A.M.，Liu，X.，Davis，D.R.，Xu，D.和Sigmund，C.D.（2011年）。脑血管紧张素能信号转导介导去氧皮质激素（DOCA）-盐在C57小鼠中的代谢作用。高血压57（3）：600-607。

7. 乔治•M•M•J.，乔治•M•M•J.霍尔•M•J.，乔治•M•M•J.，乔治•M•J.，霍尔•M•J.，2012年）。高血压：生理学和病理生理学。心脏生理学2（4）：2393-2442。

8. Huetteman，D.A.和Bogger，H.（2009年）。通过植入式无线电遥测技术直接监测实验室啮齿动物的血压。方法分子生物学573:57-73。

9. JoVE科学教育数据库。（2020年）。麻醉诱导和维持。乔夫实验室，剑桥，马萨诸塞州。动物研究

10. Kandlikar，S.S.和Fink，G.D.（2011年）。内脏交感神经在轻度DOCA盐性高血压发病中的作用。美国生理学杂志心脏病循环生理学301（5）：1965-1973。

11. Lerman，L.O.，Kurtz，T.W.，Touyz，R.M.，Ellison，D.H.，Chade，A.R.，Crowley，S.D.，Mattson，D.L.，Mullins，J.J.，Osborn，J.，Eirin，A.，Reckelhoff，J.F.，Iadecola，C.和Coffman，T.M.（2019年）。高血压动物模型：来自美国心脏协会的科学声明。高血压73（6）：e87-e120。

12. 奥斯本，J.W.，雅各布，F.，亨德尔，M.，科利斯特，J.P.，克拉克，L.和古兹曼，P.A.（2006）。穹窿下器官病变对盐皮质盐性高血压发展的影响。脑研究1109（1）：74-82。

13. Zicha，J.，Kunes，J.，Lebl，M.，Pohlova，I.，Slaninova，J.和Jelinek，J.（1989年）。血管加压素在年龄依赖性DOCA盐性高血压中的抗利尿和升压作用。美国生理学杂志256（1第2部分）：R138-145。

14. Zhao，X.，Ho，D.，Gao，S.，Hong，C.，Vatner，D.E.和Vatner，S.F.（2011年）。小鼠动脉压监测。原鼠生物学1:105-122。

15. Zwemer，C.F.（1999年）。大鼠单侧肾切除术作为肾功能的教学模型。美国生理学杂志276（6 Pt 2）：S79-85。